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生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用

伦新新; 胡志嵩; 陈园坤; 李昂; 张孟德; 张明铭; 赵晶; 杨安钢; 阎博 新乡医学院医学检验学院河南省新乡市; 453003; 空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室; 西安市710032; 空军惠州场站医院广东省惠州市; 516000; 空军军医大学基础医学院免疫学教研室; 西安市710032
bira酶   生物素修饰蛋白   真核表达载体  

摘要:目的构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索最适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法。方法采用PCR和引物退火的方法,得到BmA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至peDNA^TM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA。应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果经PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好。在IIEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰。随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础。

简介:《医学分子生物学》(CN:42-1720/R)是一本有较高学术价值的大型双月刊,自创刊以来,选题新奇而不失报道广度,服务大众而不失理论高度。颇受业界和广大读者的关注和好评。

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