干细胞培养技术大全11篇
时间：2023-07-27 16:06:19
干细胞培养技术篇（1）
在学生看图的过程中展示图1。
引出细胞分化的概念，得出细胞分化的意义。
在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。细胞分化是生物个体发育的基础。细胞分化过程中遗传物质没有变化，是基因选择性表达的结果。需要提醒的是细胞分化贯穿在整个生命周期中，不只出现在胚胎时期，为干细胞做铺垫。
分析得出细胞分化的特点：普遍性、持久性、稳定性、不可逆性。
接着，引导学生比较细胞分化与细胞分裂的区别。
通过对插图和表格的分析，使学生分清了细胞分化与细胞分裂的区别；了解了细胞分化的过程和特点；知道了细胞分化的生物学意义。
二、利用科学发展史了解科学的发展，正确看待科学技术对社会的影响
1.从科学发展史中学习科学与技术的关系
结合课本插图P118图6-12植物组织培养过程。通过对植物组织培养研究的历史发展过程的分析来总结科学发展的历史经验并揭示其规律。
1902年德国植物学家哈伯兰特（Haberlandt）提出细胞全能性概念，并用叶肉和其他多种细胞进行离体培养。在自制的营养物质中培养，仅出现一些细胞增大，未出现增殖和分化现象。
1934年荷兰植物学家（温特）F.W.Went发现了吲哚乙酸（IAA），随后又有人相继发现了IBA，NAA和2.4-D人工合成的生长素。
1934年怀特（White）用无机盐、糖类和酵母提取物配制成怀特培养基，用番茄根进行离体培养形成愈伤组织。其后证明了生长素和维生素对组培的作用，提出了细胞全能性学说。
20世纪40-50年代，斯库格（Skoog）和崔等人利用添加了腺嘌呤和生长素的培养基进行烟草培养，诱导根、芽等器官，并确定腺嘌呤和生长素诱导根和芽生长的作用。
1958年美国斯图尔德（Steward）等和德国赖纳（Reinert）等分别将培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。用实验证明了植物细胞的全能性。
从以上植物细胞全能性的研究历史，我们可知培养基是影响成功的重要的因素，正是因为科学和技术的相互支持，才使组织培养技术能够获得成功和完善。
通过植物组织培养，我们可以获得大量的克隆体，保持优良特性，缩短生产周期。为我们的生活提供丰富的物质保障，如花卉和蔬菜培育。
2.科学与技术对社会的影响
植物细胞的全能性，引发了人们对于动物细胞是否具有全能性的猜想，经过许多科学家的努力，动物细胞的体外培育不能实现细胞的全能性。几经周折后，科学家终于通过细胞重组技术证明出了动物细胞核具全能性。因为细胞核具有生物体的绝大部分遗传物质。
证明动物细胞核具全能性的就是克隆技术，也称核移植。
1996年7月5日，世界上第一只克隆羊多利（Dolly）由英国爱丁堡大学的伊恩・维尔穆特博士培育成功，但这成功并不是利用一个细胞就实验成功了，而是利用了上千个卵细胞才成功一个，其中过程也是很复杂的，是科学理论的指导下进行的。
克隆可以用于造福人类，比如说治疗性克隆，利用胚胎干细胞进行器官移植。要是被别有用心的人利用，克隆也可以影响人类的正常秩序，那后果将不堪设想。比如说克隆优等人种组成军队统治世界。
所以，科学是技术发展的理论基础，技术是科学发展的手段。科学技术是社会进步的动力，然而科学技术的也会给人类带来负效应，应正确处理好科学技术和社会的关系。
三、与现实生活的联系，进行STS教育
本节课有个探究模块，就是干细胞的知识。课标要求学生能自主搜集资料，并与同学分享成果。通过查找资料让学生及时理解关注对科学、技术和社会发展具有重大影响的生物学新进展，激发学生学习生物学的积极性。
学生分享：移植弟弟脐带血治好血癌，3岁女童健康成长；姚明加入中华骨髓库等案例。
引导学生通过讨论得出：白血病就是骨髓中的造血干细胞在分化的过程当中出现问题，导致不能正常增殖、分化出血红细胞。我们可以用正常的造血干细胞替代有问题的细胞，达到治疗的目的。脐带血里含有造血干细胞，通过移植造血干细胞就可以慢慢恢复造血功能。
干细胞可以分为三大类：全能干细胞、多能干细胞，专能干细胞
这里的脐带血就是专能干细胞，可以分化成红细胞、白细胞等各类血细胞。
引导到目前人类遇到的重大科学难题――器官移植。器官移植需要先配型，后移植，移植成功后还需要终生服用抗免疫排斥的药。有没有能绕过免疫排斥的方法呢？那就是利用自身的干细胞培育出所需要的器官移植是最好的选择，它不会产生免疫排斥反应。
干细胞培育的方法还有望用于拯救珍稀、濒危动物。适当的介绍干细胞新进展，诱导多功能干细胞（iPS）的研究在生物和医学领域具有广阔的应用前景，有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。
上述实例的介绍，让学生深刻体会到科学与技术对社会的影响力，从而激发学生强烈的好奇心和学习生物科学的兴趣。
四、课堂教学渗透STS教育的效果
干细胞培养技术篇（2）
1998年11月，美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐
述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ESce
lls）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征
是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体
外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成
成体中各种细胞的能力。
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出
生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造
人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患
者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束
在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基
因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的
，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细
胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能
性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常
的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在
体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所
有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠
外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义
限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源
于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细
胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的
是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是
十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2胚胎干细胞的最新研究
JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细
胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚
层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘
附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层，
在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且
人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们
首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠
ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细
胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的
。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不
同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。
Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精
5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的
成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至
性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中
已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使
用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子
，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f
orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞
的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正
常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶
活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久，
但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个
胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管）
。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成
的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细
胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry
oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条
件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两
层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细
胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］
。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型
表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型
细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表
型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养
条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞
边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的
自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的
ES细胞却没有这种作用［1，2］。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现
一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体
外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有
可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改
变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织
移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的
良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术
，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可
以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，
可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎
干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物
实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果
常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾
病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，
因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都
可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神
经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重
建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对
于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有
干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干
细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复
制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那
样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可
以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤
维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过
基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌
入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此
类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏
细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免
疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发
育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细
胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法，
即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技
术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种
包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植
入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“
克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”，
并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部
位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养
获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体
细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类
医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足
的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组
织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今
为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有
活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分
化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞
在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞
，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不
会形成杂种细胞。
4面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多
技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持
体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩
，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细
胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因
子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型
的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是
科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细
胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正
确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已
诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞
与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要
使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂
的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过
程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血
管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄
代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就
目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法
做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞
注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏
器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改
变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激
活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步
研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的
移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们
正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以
认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限
分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些
早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内
皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细
胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更
新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult
stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出
来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细
胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较
慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干
细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提
供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte
grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］
。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干
细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一
系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的
细胞，表现出一定的多能性［17～20］。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后
的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，
这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret
A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有
种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续
还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血
液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨
骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血
液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细
胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系
统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出
多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常
分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细
胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的
状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更
容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成
人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括
骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分
离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物
真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能
可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的
细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎
干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来
全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干
细胞及其相关技术而被治愈。
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干细胞培养技术篇（3）
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出 生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造 人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患 者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束 在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基 因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的 ，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细 胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能 性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常 的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在 体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所 有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠 外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义 限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源 于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细 胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的 是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是 十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2胚胎干细胞的最新研究
JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细 胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚 层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘 附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层， 在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且 人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们 首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠 ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细 胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的 。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不 同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。
Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精 5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的 成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至 性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中 已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使 用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子 ，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞 的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正 常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶 活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久， 但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个 胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管） 。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成 的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细 胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条 件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两 层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细 胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］ 。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型 表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型 细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表 型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养 条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞 边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的 自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的 ES细胞却没有这种作用［1，2］。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现 一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体 外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有 可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改 变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织 移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的 良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术 ，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可 以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术， 可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎 干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物 实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果 常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾 病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官， 因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神 经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重 建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对 于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有 干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干 细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复 制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那 样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可 以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤 维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过 基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌 入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此 类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏 细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免 疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发 育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细 胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法， 即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技 术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种 包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植 入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“ 克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”， 并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部 位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养 获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体 细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类 医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足 的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组 织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今 为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有 活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分 化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞 在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞 ，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不 会形成杂种细胞。
4面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多 技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持 体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 ，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细 胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因 子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型 的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细 胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正 确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已 诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞 与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要 使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂 的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过 程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血 管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄 代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就 目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法 做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞 注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏 器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改 变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激 活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步 研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的 移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们
正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以
认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限
分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些
早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内
皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细
胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更
新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult
stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出
来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细
胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较
慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干
细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提
供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte
grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］
。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干
细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一
系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的
细胞，表现出一定的多能性［17～20］。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后
的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，
这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret
A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有
种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续
还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血
液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨
骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血
液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细
胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系
统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出
多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常
分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细
胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的
状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更
容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成
人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括
骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分
离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物
真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能
可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的
细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎
干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来
全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干
细胞及其相关技术而被治愈。
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干细胞培养技术篇（4）
1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。
被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
干细胞培养技术篇（5）
The effect of RNA interference inhibited gene AKT on proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells LIU Xiao-wen*，HU Ming-ying.*Weifang Medical University.Weifang 261000，China
【Abstract】 Objective To inhibit the key gene AKT of SKOV3 cells by RNA interference and study the effect of RNA interference on ovarian cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells in vitro were divided into the control group，the empty vector group and the RNA interference group.The ovarian cancer cell proliferation，apoptosis was evaluated by MTT method and flow cytometry AnnexinV/PI assay in each group.Results MTT results showed that the cell proliferation in the RNA interference group was significantly lower as compared with the control group and the empty vector group (P 0.05).The flow cytometry AnnexinV/PI assay showed that the apoptosis rate of RNA interference group ((79.52 ± 2.31)%) was significantly higher than that of the empty vector (P
【Key words】 AKT gene； siRNA； Proliferation； Apoptosis
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。但其发病机制尚不清楚，原癌基因的过度表达和抑癌基因的突变被认为是其主要发病机制之一。因而，在基因水平研究卵巢癌的治疗成为近年来的热点。RNA干扰技术能有效地抑制特定基因的表达，它的效果在多种肿瘤细胞系的实验中已被证实。近年来有研究表明，PI3K/AKT信号通路与卵巢癌有密切的关系［1］。为证实这一研究，本实验以PI3K/AKT信号通路的下游基因AKT为靶点，通过RNA干扰技术抑制其表达，以探讨其对人卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1 材料 人卵巢癌SKOV3细胞株以及Mc-coy5A培养基（中国科学院上海细胞生物研究所），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），细胞总RNA提取和RT-PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），靶向AKT基因的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成：（AKT-homo-413）正义链CCUGGGUAAAGAAGUCAATT，反义链UUGACUUCUUUGACCCAGGTT。
1.2 主要仪器 超净工作台，CO2培养箱，酶标仪，流式细胞仪等均有潍坊医学院实验中心提供。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养与转染 人卵巢癌SKOV3细胞株用10%胎牛血清的Mc-coy5A培养基常规培养并传代。将细胞分为三组：对照组、空白载体组与RNA干扰组。RNA干扰组：转染实验操作步骤按照Lipofectamine 2000TM产品说明书，转染前1天将5×104个细胞/孔接种于24孔培养板，细胞融合为90%～95%时进行转染，用无血清无抗生素的培养基稀释siRNA和Lipofectamine 2000，转染后6 h更换培养基，48 h后进行转染后的检测。空白载体组只添加Lipofectamine 2000，其余操作步骤同RNA干扰组。
1.3.2 细胞增殖的检测 将细胞制成细胞悬液，按4×103个细胞/孔将三组卵巢癌细胞接种于96孔板中，每组细胞设5个孔及1个空白对照组，每孔加培养基100 μl和MTT液10 μl。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育4 h，弃去孔内液体加入DMSO 100 μl后混匀并于接种后24 h、48 h、72 h时进行细胞增殖检测。酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度（A值），A值越大，则表示细胞生长速度越快。
1.3.3 细胞凋亡率的检测 取对数生长期的三组细胞用0.25%的胰酶消化后，2000转离心5 min，调整细胞浓度为1×106/ml，以500 μl的结合缓冲液重悬，加入5 μl的Annexin V-FITC混匀，再加入5μl PI，混匀后避光，室温反应15 min，同时设阴性对照（不加Annexin V-FITC和PI），行流式细胞仪（美国BD公司产品）检测细胞凋亡率。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，三组间比较采用t检验，结果均以均数±标准差（x±s）表示，P
2 结果
2.1 细胞增殖的检测结果 应用MTT法检测三组细胞增殖的结果：RNA干扰组的增殖能力测定值显著低于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 细胞凋亡率的检测结果 流式细胞仪法对三组细胞进行检测，自动分析细胞凋亡率。结果显示，RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组，差异有统计学意义（P
3 讨论
PI3K/AKT信号通路参与很多重要的生物学过程的调控，但其过度激活可导致肿瘤的发生，在正常的组织中PI3K/AKT信号转导途径处于活化状态，但是该通路如果被过度激活，则可刺激蛋白质合成，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的无限增殖，成为肿瘤预后不良的标志［2］。近年来，PI3K/AKT信号通路备受关注，它已被认为是肿瘤抗凋亡的主要机制之一。目前，以该通路为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中，阻断PI3K／AKT通路也成为目前多种肿瘤治疗的热点之一［3］。相关研究指出，PI3K在约80%的早期卵巢癌细胞和一些上皮性卵巢癌中的表达均有所增高［4］。如果能有效地阻断PI3K/AKT信号通路，将为卵巢癌的治疗提供一个新的方向。
RNA干扰（RNAi）是指由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过具有序列特异性的双链RNA（dsRNA）或短发夹状RNA（shRNA）与靶基因mRNA结合而导致目的基因表达下调［5，6］。RNAi技术作为一种简单、有效的工具，对目的基因有很强的抑制作用，在癌基因组功能研究和肿瘤的基因治疗中已显示出优势［7］。siRNA表达载体因具有简便、快速、成本低、转染效率高、便于稳定筛选等优点，极大促进了RNA干扰技术的应用［8］。RNA干扰技术可以选择性地沉默目的基因，抑制目的基因的表达，从而达到抑制肿瘤的增殖生长，对肿瘤起到一定的治疗作用。利用这种技术干扰卵巢癌中的相关基因对卵巢癌的治疗有着积极的作用。
本研究则通过阻断PI3K/AKT信号通路的下游通路AKT的表达，从RNA干扰的水平分析研究AKT被沉默后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，AKT沉默后细胞的增殖能力明显减低，凋亡率显著增加，这一结果为卵巢癌的基因治疗以及RNA干扰技术提供了有力的证据，为卵巢癌的治疗提供了一个新的方向。卵巢癌的基因治疗以及RNAi技术用于肿瘤基因治疗必将能够成为一种常规的、有效的治疗手段。
参 考 文 献
［1］ 郭瑞霞，魏丽惠.磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路与妇科恶性肿瘤关系的研究进展［J］.中华妇产科杂志，2005，40(5)：358-360.
［2］ Murakami D，Tsujitani S，Osaki T，et al.Expression of phosphorylated Akt (pAkt) in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy［J］.Gastric Cancer，2007，10(1):45-51.
［3］ 曾慧敏，红，刘文贤.PI3K/Akt通路与肿瘤治疗［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15(1)：82-85.
［4］ Singh B，Reddy PG，Goberdhan A，et al.P53 regulates cell sunial by inhibiting PIK3CA in squamous cell carcinomas［J］.Genes Dev，2002，16(8):984-993.
［5］ K im VN.Small RNA s classification，biogenesis and function［J］.Mol Cells，2005，9(1):1-15.
［6］ Tomari Y，Zamore PD.Perspective machines for RNAi［J］.Genes Dev，2005，19(5):517-529.
干细胞培养技术篇（6）
中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）21-0308-01
1 无血清培养体系简介
无血清培养体系是在合成培养体系的基础上发展而来的，主要是寻找替代血清的各种可能性，使无血清培养既能进行细胞培养，又可以避免血清带来的不利影响。与含血清培养相比，具有很多的优点，无血清培养技术的发展是从上世纪七十年代开始的，其中基于生产安全性的重组药物而开发的无血清培养基，不用动物做为蛋白来源，降低了成本也加快了报批的速度，后来逐渐发展成为培养基的组成成分全部为化学已知物，更易进行目标蛋白的分离纯化，要求培养的细胞要具有较高的特异性。
一般无血清培养体系由基础培养和替代血清补充因子两部分组成，其中基础培养是零添加血清的合成培养基，按照细胞的生长要求将各种微量元素和营养物质进行合成为基础培养基。补充因子是代替血清的各种因子，包括激素、生长因子、结合蛋白等，在所有的补充因子中，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠是细胞在无血清培养基中生长所必须的，是必须具备的补充因子。
2 无血清培养体系在再生医学领域的应用
2.1 无血清培养基研制配方的应用
研究人员研究发现在无血清合成输卵管液培养基中加入胰岛素、转铁蛋白和硒，可以提高动物胚胎的发育质量，再加入牛血清白蛋白后，可以促进囊胚的发展，可以促进细胞的增殖实验。CHO、Vero等工程细胞是单克隆抗体和基因工程药物的表达载体，在对无血清培养基的研制时，要满足增殖的需要，同时也要表达目的产物。例如CS-NS0细胞是抗-CD25单克隆抗体的表达体，无血清低蛋白培养基可以满足大规模培养和抗体表达的要求，批培养最大活细胞密度和最大抗体浓度都达到很高。基于人胚肾细胞培养的无蛋白培养基，可以用于对抗聚乙烯介导转染慢病毒，具有较高的滴度，成本也较低。针对Vero细胞源乙型脑炎疫苗而研制的无血清培养基，没有任何动物源性成分，疫苗只要添加稳定剂，就可以在常温下保存。
2.2 无血清培养体系在细胞增殖方面的应用
雌二醇是无血清培养基中经常添加的激素，如果其浓度较高，会抑制毛囊的生长；PDGF、TGF-β、FGF是三种信号通路，可以促进间质干细胞的生长分化，如果其中之一受到抑制作用会影响间质干细胞的生长，如果三种信号通路结合好，则会使间质干细胞在培养基中传到五代。如果无血清培养基钙浓度较低，下调Smad蛋白介导会维持角膜基质细胞的表型，角膜的上皮细胞也可以长期进行传代培养。中草药是我国的传统医学代表，细胞无血清培养技术也影响到中草药的作用机制，研究显示黄芪可以增加人皮肤表皮干细胞将粒酶转化为录酶，并增强其活性。
2.3 无血清培养基在细胞和组织移植中的应用
无血清培养体系安全性较高，所以广泛应用于基于生物细胞培养的细胞或组织移植治疗中。在无血清培养基中培养骨髓基质干细胞，可以获得与含血清培养基相同的增殖效果，如果患者属于特殊贫血类型并且体重较轻，可以诱导人体成骨，并可以抑制异位骨，这方面比含血清培养更具有优势。采用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞，可以在无血清培养的条件下抑制细胞的凋亡，使骨髓间充质干细胞可以存活于下肢缺血性疾病的治疗中。
如果某些细胞和组织具移植的可能性，如果研制的培养基可以长久的维持细胞特性，这将会促进移植的成功率。新鲜刚分离的肝细胞具有特有的分化属性，此属性如果存在于含血清培养基中就会丧失掉，如果在无血清培养基中添加地塞米松、表皮生长因子、垂体提取物等，肝细胞就会保持3-4周的分化属性，这对于需要肝部移植的患者来说，是一大福音。对由幼年牛软骨外植体组成的无血清培养基进行观察后发现，外植体的力学性能和生物含量得到了有效的加强，其性能一直比较稳定，细胞充满活力。含血清基外植体的力学则有所下降，并且损失了一定的聚糖并发。这充分说明了无血清培养基可以延长成熟细胞的特性，在组织互作无血清培养体系中，需要添加特定的材料来介导才能促进上皮间质的互作。
2.4 无血清培养基在肿瘤治疗方面的应用
无血清培养基具有许多优点，包括可以使细胞生存所需的营养物质得到保证，除掉了血清中的促分化剂，对于肿瘤的发现和治疗具有重要的应用价值。无血清培养可以增加SP2/0细胞中的瘤细胞，这些瘤细胞都具有干细胞特性，可以将SP2/0中的肿瘤干细胞进行富集。细胞外基质可以影响肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，无血清培养基中加入纤维连接蛋白后来培养人乳腺癌细胞，可以上调基质 金属蛋白酶的活性。单克隆抗体可以阻断整合素，可以抑制基质金属蛋白酶的活化反应。在进行肿瘤治疗时，对体外诱导扩增CIK细胞及抗肿瘤活性进行研究，分别采用无血清培养和含血清培养基，结果显示无血清培养基可以代替含血清培养基，某些方面还有含血清培养没有的优势。研究人员研究了适合于B16黑色毒瘤细胞培养的无血清培养基，对树突状细胞进行预防。这说明无血清培养的免疫活性细胞可以用于肿瘤的生物免疫治疗。
2.5 无血清培养基在外周血淋巴细胞抑制中的应用
抑制外周血淋巴细胞的无血清培养基是一种生物制剂，主要成分是凝集素、基础培养基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液，外周血淋巴细胞培养基不用动物或者人的血清，不仅降低了培养基成本，还可以降低疾病的传播，此淋巴细胞培养基可以增强淋巴细胞的转换率，促进淋巴细胞的分裂，抑制效果显著，可以广泛用于染色体核型的临床诊断，是康复率低的淋巴疾病的福音。
3 小结
无血清培养体系具有含血清培养体系无法达到的优势，但需要在培养通用性、生产高效性以及成本和安全方面进行改进，未来随着对细胞营养、细胞代谢 、细胞凋亡以及外源蛋白表达等的不断研究，采用更多的科学实验方法，可以使无血清培养基的开发更加快捷，使模拟细胞微环境的无血清培养体系可以广泛应用于生物科学领域，特别是再生医学领域，为更多的疑难杂症以及再生性疾病提供更多的服务。
参考文献
干细胞培养技术篇（7）
Abstract：［Objective］To separate rat precartilaginous stem cells (PCSCs) and establish immortalized precartilaginous stem cell(IPCSC) strain which provides stable cell resource for cell-transplantation and gene therapies.［Method］PCSCs were isolated by discontinuous Percoll gradient centrifugation. The specific marker (anti-FGFR-3) of PCSCs was used to identify the cultured cells by immunocytochemistry. Plasmids pCMVSV40T/PUR containing the simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) were transfected into the PCSCs by electroporation method. Colonies were isolated by puromycin selection and amplified to cell strain.The expression of SV40Tag in the amplified cell strain was identified by immunocytochemistry and RT-PCR. Anti-FGFR-3 and anti-PCNA were used to identify the cultured cells after puromycin selection.［Result］One anti-puromycin cell clone was obtained， which was confirmed as FGFR-3 positive PCSCs with the capability of proliferation. The mRNA and protein expression s of SV40Tag were detected in transfected cells after stable transfection. The transfected cells were amplified to immortalized cell strain maintained for more than 30 passages， named immortalized precartilaginous stem cells(IPCSCs). The population doubling time and anti-PCNA positive confirmed the high capability of proliferation.［Conclusion］Rat precartilaginous stem cells were purifued and immortalized precartilaginous stem cell strain was established successfully. It will provide stable cell resource for the basic researches and cell-transplantation therapies.
Key words：precartilaginous stem cells; immortalization; simian virus 40
骨骺干细胞(precartilaginous stem cells，PCSCs)是控制生长期动物肢体生长的、能定向分化的成体干细胞[1]，它作为组织工程的种子细胞，可用于软骨与骨缺损的细胞替代治疗[2]。由于PCSCs在第五代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的PCSCs。建立永生化骨骺干细胞株，将为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供大量表型、基因型稳定的骨骺干细胞。本研究拟将猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)转染至原代培养的大鼠LaCroix环的骨骺干细胞，以期建立永生化骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。
1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 实验动物与主要试剂 出生24 h内的SD大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；Embryo MaxTM-DMEM干细胞专用培养基、CompleteTM Trypsin Solution购自CHEMICON公司；EGF、bFGF购自Cytolab公司；胎牛血清、青-链霉素购自Gibico公司；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；兔多克隆抗体FGFR-3(c-15)购自Santa Cruz公司；质粒pCMVSV40T／PUR和大肠杆菌菌株分别获赠于瑞典Jan Holgersson教授和同济医院田玉科教授；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；内切酶NotI和XhoI购至Toyobo公司；Trizol试剂盒购自GIBCO公司；兔抗鼠SV40Tag抗体和兔抗鼠anti-PCNA购自NeoMarkers公司；SP9000免疫组化试剂盒、ZLI29032浓缩型DAB试剂盒和FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉公司。
1.1.2 引物设计 根据大鼠基因序列设计内参β-actin引物，上游：5'-GTTGACATCCGTAAAGACC-3'，下游：5'-CACCAATCCACACAGAGTA-3'，产物长度为170 bp；根据SV40Tag基因序列设计引物，上游：5'-TATCTTFCAGGT TCAGGG-3'，下游：5'-TGGAATAGTCACCATGAATG-3'，产物长度为558 bp。引物由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCSCs的分离与鉴定 参考黄仕龙等的方法，以显微手术器械剪取新生24 h内的SD大鼠股骨下端骺板两侧的La Croix环处的组织[4]，并将其充分剪碎，以CompleteTM Trypsin Solution消化5 min，再以0.1％的Ⅰ型胶原酶37℃消化15～24 h，将细胞按1×106／ml接种于含10 ng／ml bFGF、10ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中培养。培养48 h后将原代细胞以CompleteTM Trypsin Solution消化，以3 μm单细胞过滤器去除聚集的细胞团成为单细胞悬液，用D-Hank's洗涤后以含0.01％DNA酶的培养基重悬细胞，移至percoll密度梯度液顶层，400 g离心1 h后取第4层细胞以含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基中置于37℃、5％CO2培养箱中培养。第2代骨骺干细胞消化后接种于放有灭菌小玻片的12孔板中，将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞长满玻片50％～60％时以4％的多聚甲醛固定30 min，Triton-X100破膜20 min。应用HRP／DAB免疫细胞化学法按照SP试剂盒说明书步骤进行FGFR-3抗体染色，苏木素复染。
1.2.2 质粒扩增、提取及鉴定
含质粒pCMVSV40T／PUR的大肠杆菌在含有氨苄青霉素25 μg／ml和四环素10 μg／ml的LB培养基中以250 r／min摇菌12～16 h，质粒提取按照质粒提取试剂盒说明进行。获得的质粒以灭菌三蒸水洗脱后置于低温冰箱保存。取每个反应体系1 μg应用Xho I和Not I分别进行单酶切和双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2.3 电穿孔转染法转染骨骺干细胞
将PCSCs接种于100 ml培养瓶中，调整细胞密度使其在转染当天能收获(2.5～3.0)×105个对数生长期的细胞。用CompleteTM Trypsin Solution消化瓶内细胞。用预冷的PB-蔗糖(272 mmol／L蔗糖，7 mmol／L磷酸钠缓冲液pH 7.4，1 mmol／L MgCl)离心洗涤细胞2次。用20 μl冰PB-蔗糖重新悬浮细胞，加入质粒pCMVSV40T／PUR 1.0 μg，轻轻混匀。移入0.2 mm的电转杯中冰浴5 min。电转参数设置：总电压200V，调幅100％，调频40 kHz，脉冲时间1 ms，脉冲值5，脉冲间隔1 s。电转结束立即加入1 ml含10 ng／ml bFGF、10 ng／ml EGF和0.9％FBS的DMEM培养基，冰浴10 min后，接种于24孔培养板。置37℃、5％CO2培养箱内继续培养。
1.2.4 转染细胞的筛选、扩大培养及鉴定
细胞转染后24 h，以含0.5 μg／ml 嘌吟霉素的培养基筛选12～14 d，阳性克隆以含0.4 μg／ml嘌呤霉素培养基扩大培养。以转染后的细胞制作细胞爬片，应用免疫细胞化学法进行FGFR-3抗体染色，应用FITC标记的免疫荧光法检测SV40Tag抗体染色。用Trizol试剂盒提取第2代骨骺干细胞和第4、10、30代永生化骨骺干细胞的总RNA，进行逆转录。内参B-actin的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，53℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。SV40Tag的PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后进入30个循环：94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 50 s，最后再72℃延伸8 min。PCR产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.5 绘制细胞生长曲线和计算群体倍增时间(PDT) 将第2、6、10代骨骺干细胞(PCSC2、PCSC6、PCSC10)及转染后第30代永生化骨骺干细胞按1×102个/孔接种于24孔板，每隔24 h常规消化3孔细胞并计数，绘制生长曲线，按照下列公式计算细胞PDT：PDT=[1g2／(1gN11gN0)]×t，其中N1和N0分别代表接种后和培养t h后的细胞数。统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。不同细胞间比较采用单因素方差分析，P
2 结 果
2.1 PCSCs的分离与鉴定 Percoll梯度离心分离得到的骨骺干细胞贴壁生长，折光性好，以梭形或三角形为主(图1)。免疫细胞化学检测可见细胞呈FGFR-3染色阳性，细胞染色部位主要在胞膜(图2)。
2.2 质粒扩增、提取及鉴定
质粒pCMVSV40T／PUR酶切产物电泳分析(图3)显示质粒载体经Not I或Xho I单酶切各得到一条约5.3 kb的条带；经Not I和Xho I双酶切得到约2.3 kb和3.0 kb的2条带，目的基因约2.3 kb与Genbank中的SV40Tag cDNA长度一致。
2.3 转染细胞的鉴定
转染细胞经筛选培养后获得1个阳性细胞克隆。贴壁培养的细胞形态与原代培养的骨骺干细胞没有明显差别。免疫细胞化学检测显示永生化骨骺干细胞的FGFR-3和PCNA抗体染色阳性(图4、5)，免疫荧光检测显示永生化骨骺干细胞的SV40Tag抗体染色阳性(图6)，RT-PCR结果显示在约560 bp处有一特异形扩增条带，而未转染的原代细胞未见条带(图7)。
2.4 细胞生长曲线和群体倍增时间 第2、6、10代的骨骺干细胞以及转染后第30代永生化骨骺干细胞生长曲线均呈“S”形(图8)，第10代后骨骺干细胞增殖速度明显变慢停止，细胞出现衰老现象；第30代骨骺干细胞增殖速度明显快于第6、10代骨骺干细胞。永生化骨骺干细胞一般6～7 d传代1次。四者的PDT分别为(29.1±3.1)h，(34.2±3.0)h，(43.5±3.4)h，(28.7±2.9)h，其中PCSC2和第30代IPCSC的PDT明显低于第6、10代骨骺干细胞(P0.05)。图1 Percoll梯度离心获得的PCSCs×200 图2 PCSCs的PGFR-3染色，苏木复染×200 图3 质粒pCMVSV40T/PUR酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析 ①Marker VI(由下至上依次为250、1 000、2 500、5 000、7 500、1 000 bp);②经双酶切得到约2.3 kb和3.0 kb的2条带；③经Xho I单酶切得到1条约5.3 kb的条带；④经Not I单酶切得到1条约5.3 kb的条带 图4 第30代IPCSC的FGFR-3抗体染色，苏木素复染×200 图5 第30代IPCSC的PCNA抗体染色×100 图6 第30代IPCSC的SV40抗体染色×100 图7 RT-PCR检测培养细胞SV40Tag mRNA的表达（170 bp处为内参β-actin，560 bp处为SV40Tag） ①Marker I(由下至上依次为100、200、300、400、500、600 bp);②第2代PCSCs ③第4代IPCSC ④第10代IPCSC ⑤第30代IPCSC 图8 PCSCs和IPCSC的生长曲线
3 讨 论
1999年Robinson等人分离出骨骺干细胞[1]，为研究骨骺发育问题提供了新的思路，同时也为组织工程找到一种所需要的种子细胞。目前骨骺干细胞的研究已成为骨科领域的一个新热点。近年来游洪波等对骨骺干细胞进行了纯化[5]，为研究骨骺干细胞向软骨细胞分化、更深入地进行软骨组织工程的研究奠定了基础。但骨骺干细胞的研究还有许多的难题等待作者去解决。首先，由于骨骺干细胞在第5代左右即开始分化[3]，原代细胞培养技术尚不能在体外获得大量表型一致的骨骺干细胞。细胞的增殖一直是一个瓶颈问题，如何获得组织工程所需要的种子细胞的数量，国内外尚未有很好的解决方案。其次，要明确使细胞向软骨及骨细胞分化的基因和环境信号、如何控制骨骺干细胞向软骨细胞分化，都需要进一步深入研究。
猿肾细胞病毒SV40由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和2种抗原(大T抗原和小T抗原)组成［6］。大T抗原为细胞转化启动所必需，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须依赖大T抗原的持续表达[7]。SV40Tag是目前较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一，可通过与生长抑制因子pRB、p53和SEN6相互作用，避免细胞进人凋亡，延长细胞寿命，并使细胞最终度过危机期，实现永生化[8]。本实验利用电穿孔转染技术将含有SV40Tag的质粒转染体外培养的大鼠PCSC。RT-PCR及免疫荧光检测SV40Tag抗体证实SV40Tag已稳定转导入骨骺干细胞中，并在基因和蛋白水平均有表达。转染后细胞形态与原代骨骺干细胞无明显区别，以多角形和短梭形为主，一般5～6 d传代1次。同时转染后细胞的免疫细胞化学FGFR-3抗体和PCNA抗体染色均为阳性，证实细胞在转染后仍具有骨骺干细胞的基本特性。该细胞株目前已传到了第30代，尚未观察到明显的分化现象。这些结果说明SV40Tag能成功地介导体外培养骨骺干细胞的永生化。
本研究成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠骨骺干细胞株，为研究骨骺细胞分化机制以及组织工程提供稳定的细胞来源。
【参考文献】
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干细胞培养技术篇（8）
研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。
软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。
文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”
研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。
干细胞培养技术篇（9）
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)02-0218-04
Conservation of the tissue-engineered acellular vascular scaffold with freezing and drying technique
LIU Bin1, ZHANG Man-jing2, XIA Wei1, LU Kai-hua1,GUO Shu-zhong1
(Department of Plastic Surgery, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032, Shaanxi,China 2.Department of Platic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College)
Abstract: ObjectiveTo investigate the feasibility of a freeze-drying technique preservation protocol on the acellular vascular scaffold.MethodsAcellular vascular scaffolds were treated by freezing and drying technique at -70℃(6.67×10-4kPa) for 6h,then appraised the scaffolds by histological and ultrastructural observation and evaluated its biocompatibility and biomechanics.ResultsIt was shown that the main performance indexes of the freeze-drying treated acellular scaffolds changed unremarkably in compared with the untreated ones.ConclusionFreeze-drying technique can be a good preservation protocol for tissue-engineered acellular vascular scaffold.
Key words: tissue engineering blood vessels; tissue engineered acellular vascular scaffold; freeze drying
随着科学技术的发展,组织工程学的兴起为从根本上解决血管移植物替代这一问题带来了新的曙光。组织工程血管是组织工程学领域的产物之一,是一种新的有望彻底解决小口径人工血管移植问题的方法。脱细胞血管基质因其具有取材方便、低免疫源性、机械性能良好等优良特性,在血管组织工程研究领域中得到了越来越广泛的应用[1-2], 成为该领域支架材料研究方面的一个热点。通过前期的系列试验研究,我们初步摸索出一种脱细胞血管支架快速制备、消毒及结构疏松化的方法。然而脱细胞血管材料制备后如何长期保存又是一个需要面临和解决的问题,因此我们希望找到一种简单可行的储存技术来长期保存制备的脱细胞血管支架以达到临床和科研上 “随用随取”的目的。
在本实验研究中我们使用冷冻干燥技术处理制备的脱细胞血管支架,通过对处理后的支架材料进行组织,超微结构观察、生物力学评估、细胞毒性测定以及动物体内的组织相容性检测,研究冷冻干燥处理对脱细胞血管支架材料生物相容性和生物力学特性的影响,从而进一步评估冷冻干燥技术作为该材料长期储存方法的可行性。
1材料和方法
1.1血管材料准备及脱细胞血管支架的制备:选取8～12月,体重在2～2.5kg的健康雄性大耳白兔20只,在麻醉、相对无菌条件下,取出兔股动脉,置于4℃含青霉素和链霉素各180mg/L的无菌PBS液中,热缺血时间不超过15min。无菌PBS液冲洗数次去除血液杂质,锐性去除附属结缔组织和脂肪成分以及大部分血管外膜。截取长度为5cm、无明显分支、内径约3mm的动脉40根作为实验材料。将所取得的30根血管材料反复冻融加超高压处理后,置人含有15μg/ml RNase A,150μg/ml DNase I (Sigma)溶液中,冲洗48h(37℃,5%CO2环境内搅拌),然后用PBS洗涤1天。
1.2脱细胞血管支架的冻干处理:取20根制备好的脱细胞血管支架材料,根据血管材料口径和长度套入相应的玻璃棒上,于普通冰箱冷冻室内-4℃预冷24～48 h,然后在-80℃低温冰箱中速冻24h,再置入-70℃、6.67×10-4 kPa的干燥冷冻机(LGJ-10C,上海)内6h作冷冻干燥处理。用包装袋封装后,置常温下保存待用,并注明冻干日期、血管种类、长度及口径,保存8周以上后使用。使用时,将血管材料由包装袋中取出,浸泡于生理盐水中复温约10min,血管变软后由玻璃棒上轻轻取下,以0.1%过氧乙酸溶液消毒。
1.3组织学观察
1.3.1 光学显微镜:4%多聚甲醛分别固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.3.2 扫描电镜:3%戊二醛分别预固定经冻干-复水处理及经未冻干处理的脱细胞血管支架标本,4℃储存送检。标本在S-3400N型扫描电镜下观察。
1.4 兔血管内皮细胞的分离培养:无菌条件下取出兔胸主动脉。去除附壁血细胞,剪除外膜多余脂肪和筋膜。分别注入0.125%、0.25%胰酶和0.1%胶原酶消化液,使管腔充盈,37℃作用15、12、17min,松开一端,收集消化液; 注入含10%胎牛血清 M199培养液再次冲洗管腔;将消化液和冲洗液并800r/min,5min离心,弃上清;加M199培养液,吹打均匀制成细胞悬液,以2×105/瓶浓度,传入25cm2培养瓶;37℃、5%CO2培养箱,每24h半定量换液;当原代培养至融合形成致密的单层细胞时即可传代,实验采用的细胞为第3～7代细胞。
1.5 接触细胞毒性测定:实验组将约3mm2 的无菌医用粘合膜粘贴于一次性细胞培养皿中央,无菌条件下取5mm×5mm大小冻干处理后脱细胞血管基质,黏附于细胞培养皿中。作为阳性对照组,将一滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培养皿中央的脱细胞血管基质上;阴性对照组,培养皿中央医用粘合膜粘贴未经冻干处理的脱细胞血管基质。将准备的内皮细胞悬液依次接种于上述培养皿中,CO2培养箱中(37℃,5%CO2)孵育48h后倒置荧光显微镜下观察细胞与培养皿中央材料毗邻部位的形态。
1.6羟脯氨酸含量测定:利用羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成)及多功能光度计分别测定分别测定新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料羟脯氨酸含量的变化。
1.7 处理前后材料的机械力学特性的测定:将新鲜血管及冻干处理前后脱细胞血管支架材料在INSTRUIN 1122生物力学测试系统(Instron Uo.USA)下行单轴拉伸试验,测定最终抗张强度和缝合强度。
1.8 血管支架材料冻干-复水处理后体内生物相容性的初步研究:大耳白兔以戊巴比妥钠(30～40mg/kg,iv)麻醉,取仰卧位固定于手术台上,腹部两侧去毛,碘伏消毒,铺巾。在腹部两侧各做2个切口,长约1cm,切开皮肤全层后以眼科剪仔细分离皮下形成一腔隙。把脱细胞血管基质及经冻干-复水处理的脱细胞血管基质分别植入皮下腔隙中,每侧植入2块材料,铺平,缝合切口,再次以碘伏消毒切口。无压力包扎,饲养。观察兔全身及材料种植局部反应,并分别于术后7天、14天、21天及28天取出标本,4%多聚甲醛分别固定血管支架标本,常规石蜡包埋切片,行苏木精伊红 (HE)染色后在光学显微镜下观察。
1.9 统计学分析:数据采用SPSS13.0软件处理,结果以均数x±s表示, 数据以均数±标准差表示,采用方差分析比较, P
2结果
2.1形态学观察
2.1.1 大体形态:脱细胞处理组管壁变软塌陷,但弹性良好(图1);经过冷冻干燥保存处理后的脱细胞血管支架形成特有的海绵状多孔性结构(图2);复水后脱细胞血管支架形态及大体结构完全复原(图3)。
2.1.2 经冻干处理脱细胞血管基质的组织学观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架,其管壁胶原纤维波浪状结构均保存基本完好,同未经冷冻干燥处理的脱细胞血管支架相比,结构无明显差异(图4、5)。
2.1.3 超微结构观察:经过冷冻干燥处理后的脱细胞血管支架结构较未处理前略疏松,但整体结构保持完好(图6、7)。
2.2 接触性材料细胞毒性:冻干处理前后的脱细胞血管材料均无细胞毒性,在材料的周围未发现内皮细胞的接触或者生长抑制,测试样本周围的内皮细胞形态正常,共培养的血管内皮细胞增殖旺盛(图8、9)。
2.3 正常血管与冻干处理后脱细胞血管基质的胶原含量的测定:血管材料的羟脯氨酸含量各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中,其羟脯氨酸含量(胶原含量)与冻干处理前相比无明显变化,见表1。
2.4 材料的机械力学特征:血管材料的最终抗张强度与缝线保留强度各组两两相比无统计学意义(P>0.05),即血管材料在上述各处理条件组中基本力学特征在经冻干处理前后无明显变化,见表2。
2.5经过冻干处理后血管支架材料体内生物相容性
2.5.1 术区情况及植入材料大体外观:家兔腹部皮下埋植冻干处理脱细胞血管支架后,精神、食欲均良好。手术区术后第2天或第3天出现轻微红肿,术后第4天到第5天消退,埋植处高出周围皮面。切口均愈合良好,术后7天拆线。未发现明显红肿,无脓性分泌物等情况。手术后埋植脱细胞血管支架而隆起的高度随时间的推移逐渐降低,到术后3周时已基本与周围皮肤一致。
大体观察:1周组材料体外可触及、轮廓清晰、质地中、血管浸润明显、纤维包膜可与材料分离(图10)。3周组材料外周包膜变薄,与支架材料结合紧密,材料表面有降解吸收现象,失去网状状结构。4周组材料几乎完全被吸收,材料周围组织无明显坏死及感染。
2.5.2 植入材料组织学检查:2周组未经冻干处理的脱细胞血管基质及经冻干处理的脱细胞血管基质材料HE染色镜下仅见少量中性粒细胞浸润(图11、12)。3周后炎细胞数明显下降,与其下组织分界不清,包膜和材料中有中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞为主的炎性细胞浸润并伴增生的成纤维细胞。4周组材料进一步吸收变薄,呈稀疏的线条状,浸润炎性细胞数量明显减少。两组材料体内反应过程基本相同,各组均未见组织坏死。植入材料大体外观及组织学检测结果表明,脱细胞血管基质在冻干处理前后具有良好的体内生物相容性。
3讨论
传统生物材料的保存方法主要有深低温冻存和冷冻干燥保存两种。对于冻干保存生物材料的生物学特性的研究国内外已不少见,但多集中在眼角膜、骨骼及皮肤等片状材料方面。对于脱细胞血管基质支架此类管状生物材料的生物力学和化学特性影响的研究,国内外尚无文献报道。因此在我们的研究中将冷冻干燥技术应用到脱细胞血管支架此类管状生物材料的保存处理中, 以评估冻干技术作为脱细胞血管支架材料长期保存方法的可行性。
真空冷冻干燥技术是将真空技术、冷冻技术和干燥技术结合起来的一种综合性技术。其最先应用于血浆、血清、酶制剂、生物细胞、人体组织等生物制品和材料的冻干保存。早期的研究发现,部分蛋白制品通过冷冻干燥技术处理后的真空包装可以达到在室温下保存两年甚至更长时间而不发生变质的良好效果[4],从最早应用于处理生物学材料[5],后历经应用氟利昂-12改良处理法[6],直到今天使用冻干同种异体骨成功修复牙周骨缺损[7], 利用冻干技术制备多孔的组织工程支架材料[8]。冻干技术在组织保存及材料制备方面的研究走过了近六十年的发展历程。
冷冻干燥处理对于脱细胞血管材料的生物学特性的影响是本试验中主要的考察指标。主要包括材料的细胞毒性、生物力学以及生物相容性等。在我们的研究中,对经冷冻干燥保存处理的脱细胞血管基质材料的上述指标进行了体外和体内的测试。通过体外试验,我们利用兔的血管内皮细胞对经冷冻干燥处理并保存后的脱细胞血管支架的接触细胞毒性进行检测。结果发现:经过冻干保存处理的脱细胞血管基质其材料毒性并未增加,材料周围未内皮细胞形态正常且未发现内皮细胞的接触或者生长抑制。由此我们可以得出:经过冷冻干燥处理并保存的脱细胞血管基质在体外具有良好的细胞生物相容性。另外在体内试验中,我们在兔腹部皮下埋植脱细胞血管支架,通过对不同时间段取材的组织及形态学分析,初步证实了冷冻干燥处理前后,脱细胞血管支架材料都具有良好的体内生物相容性。
脱细胞血管基质的主要成分为胶原纤维,而胶原纤维的主要分解产物为羟脯胺酸。因此我们的实验中通过测定冻干保存处理前后材料羟脯胺酸的含量,来判断上述处理是否会破坏支架材料的胶原结构。结果发现经冻干保存处理前后的脱细胞血管支架其羟脯胺酸含量基本一致,从而证明冻干保存处理对于脱细胞血管支架的胶原结构无明显影响。
足够的初始强度和弹性对于组织工程血管支架的材料来说是非常重要和必需的。因此,我们在试验中测试了冻干保存处理前后血管组织的强度和弹性,以判断冻干处理对于脱细胞血管基质材料的主要生物力学指标的影响。体外测试的结果证实经过冻干保存的脱细胞血管支架其强度和弹性虽然出现了轻度的降低,但是这种改变不具有明显的统计学意义。
本研究通过对冻干保存处理前后脱细胞血管支架材料生物化学与生物力学特性的检测分析,初步证明:经过冻干保存处理的脱细胞血管材料,其细胞毒性、生物力学特征以及胶原结构与未经处理前相比没有明显的差异,冻干保存后的材料依然具有良好的生物相容性。因此我们认为:冷冻干燥处理作为组织工程脱细胞血管支架此类管状生物材料的长期储存方法是可行的。
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干细胞培养技术篇（10）
1 人胚胎干细胞的来源
胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团(Inter cell mass，ICM)或早期胚胎的原始生殖细胞(Embryonic primordial germ cell， EG)，是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能。1998年，Thomson等〔1〕首次报道在体外受精5 d的人囊胚中成功分离出人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cell，hESC)，体外培养维持不分化状态均传代30代以上。同年，Shamblott〔2〕报道了从受精后5～9 w的人胚胎中含有原始生殖细胞的生殖嵴和肠系膜中成功分离培养出5 个多潜能干细胞系，其特征类似于胚胎干细胞，可连续传代且核型稳定。免疫组织化学分析表明其可分化为包括所有3 个胚层的组织。Thomson等和Shamblott分别用人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞建立了胚胎干细胞系。Hwang等〔3〕应用体细胞核转移技术方法获得了胚胎干细胞，该方法将来源于供体体细胞的细胞核移植进入去除细胞核的卵母细胞，然后在体外将其培养至胚泡期，分离出胚胎干细胞，并可在体外将其定向诱导分化为各种特定的功能细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。
2 人胚胎干细胞的生物学特性
人胚胎干细胞有以下特性：(1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞;(2)具有种系传递功能;(3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的 ES 细胞;(4)易于进行基因改造操作;(5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常;(6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性，具有维持端粒长度，保持干细胞增殖能力的重要作用〔4〕。
人类ES细胞在形态和行为上与鼠ES细胞不同，其生长缓慢，往往形成扁平而非球形集落〔5〕，未分化人类ES细胞有典型形态，包括高核胞质比例和多巨核。人类ES细胞表达特征细胞表面标记，如SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181，但不表达SSEA1。人类ES细胞来源于非常早期的胚胎，有正常染色体并能延长增殖，它们表达高水平的端粒酶，没有复制衰老现象，提示这些未分化ES细胞系能无限增殖，有可能培养出无限数量的分化衍生物〔3〕。白血病抑制因子(LIF)能阻止鼠ES细胞分化，使其保持未分化状态，当去除LIF或饲养层细胞，许多类型的ES细胞将自动分化形成与种植后胚胎组织相似的拟胚体，这种球形结构包括3个胚层结构〔6〕。人类ES细胞可分化成各种细胞类型，包括内胚层、神经细胞和肌肉细胞等。当人类ES细胞注入免疫缺陷鼠体内，即形成有多种细胞类型分化的畸胎瘤，包括呼吸上皮和内脏上皮(内胚层);平滑肌、软骨、骨和连接组织(中胚层);神经组织、上皮和毛发(外胚层);及许多未分化细胞类型〔7〕。
3 人胚胎干细胞的建系和培养
3.1 胚胎干细胞的建系 在体外受精(IVF)治疗不孕症的过程中，B超介导下经阴道穿刺获取人卵母细胞，将卵母细胞和精子体外受精后培养至囊胚。然后可用免疫外科手术法、组织培养法、机械剥离法等，去除囊胚外层的透明带，分离出囊胚中的ICM。目前最常用的胚胎是冷冻胚胎，其次是新鲜胚胎、克隆胚胎。
将临床上人工终止妊娠的5～9周龄胎儿，用加有青霉素、链霉素的PBS反复洗涤，剪开胎膜，小心分离出胚胎，在解剖镜下用眼科剪剪取胚胎生殖嵴及周围组织，剪碎，用消化液消化，离心去上清，加入培养液，置于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。一段时间的培养后，hESC从内细胞团中爬出，经过反复传代，建成hES细胞系。
3.2 胚胎干细胞的培养
3.2.1 常规培养液 常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以 DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。
3.2.2 无血清培养基 血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于 ESC 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液〔8〕、化学合成培养液〔9〕进行 ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基〔10〕。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化，是因为血清中富含中胚层诱导因子，如骨形态形成蛋白(bone morphogenic proteins，BMP)等〔11〕。
3.2.3 饲养层(feeder layer) 饲养层〔12〕培养体系的建立是ESC体外培养建系中最常用的一种技术方法。饲养层细胞经射线照射或丝裂霉素 C 处理后，虽然失去分裂能力，但仍能保持生存，并有同化培养液的能力，为胚胎发育提供一些必需因子，如成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等细胞分化抑制因子，促进其增殖，抑制其分化。目前常用的饲养层有STO、小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblast，PMEF)、SNL (G418R 基因和 LIF基因转染的 STO)、HBC5637等。其中 MEF 以其易于取材、抑分化效果好等特点而被广泛应用〔13〕。但Stacey等认为饲养层技术存在多种细胞因子可使ESC的研究及未来的临床应用复杂化〔14〕。使用人源性体细胞作饲养层建立一株无动物源性蛋白污染的细胞系，可能将为今后临床治疗性的应用提供安全的来源。Richards〔15〕等报道流产胎儿皮肤、肌肉细胞、成人输卵管上皮细胞体外培养后均能够支持hES细胞的体外扩增，并且他们使用人血清代替SR或胎牛血清。CHENG〔16〕等报道用人的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSC)作为饲养层细胞支持hES细胞的生长，经过13代的传代，细胞仍保持hES细胞未分化状态的分子生物学的特征。安世民〔17〕等通过人胚胎干细胞经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层，研究表明来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。
3.2.4 无饲养层培养方法 目前已报道的有三种无饲养层培养方法。(1)Xu 等提出以MEF的条件培养液作为添加成分，辅助以Matrix〔18〕。(2)在培养液中加入TGFβ、LIF及bFGF，辅助以Fibronectin 〔19〕。Carpenter 等〔20〕建立了长期无饲养层培养hESC 的培养体系。该系统以85 % Knockout DMEM 为基础培养基，用15% KnockoutSR 和bFGF 替代血清，在此基础上添加保持未分化和促进hESC 增殖的细胞因子：TGFβ1、LIF 和Fibronectin基质。其中Fibronectin 可以增加细胞与培养皿的黏附，并可通过其受体Integrin 激活一系列信号途径调节细胞的活动，包括细胞的增殖、凋亡和分化等。但与MEF 饲养层上生长的hESC 相比，其增殖和分化潜能均略降低。且SR 含Albumax，是一种富含脂类的牛血清白蛋白，故有待进一步优化。(3)通过使用特异性化学药物激活Wnt信号途径来维持ES细胞在无饲养层条件下的生长〔21〕。近来，Bigdeli等〔22〕报道利用人成纤维细胞来源的培养基，无需培养基质包被培养皿，成功建系，该方法具有大规模生产的能力，可很好的应用于细胞治疗及毒性试验等不同的情况中。 然而这些培养方法是否能够维持hESC长期体外生长而不改变其特性，长期培养过程中是否会更易于产生异常核型的ES细胞，尚有待于观察。
4 人胚胎干细胞的实验研究及临床应用
4.1 人胚胎干细胞的实验研究 人ES细胞具有多向分化潜能，能分化为属于内胚层、中胚层和外胚层范畴的多种类型细胞:包括神经细胞、肝细胞、造血母细胞、分泌胰岛素细胞、心肌细胞、内皮细胞等。人胚胎干细胞定向诱导是指在体外把人胚胎干细胞定向诱导成分化成熟功能细胞，而横向分化则是把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的“干细胞”或功能细胞，不论定向诱导，还是横向分化，它们的共同基础都是干细胞基因表达的调控。定向诱导分化根据hESC在离体条件下可分化出不同胚层的分化细胞这一特点，将hESC 与不同类型的细胞共培养或加入相应的生长因子诱导干细胞定向单一类型的细胞分化。目前，hESC体外诱导分化的模式主要有诱导分化、自发分化和基因调控分化等。大量的研究〔23〕表明转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白 (Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。Laura等〔24〕将人胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化的心肌细胞，培养观察了达3个月，并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况，以RTPCR来评估编码离子通道的亚基的表达;发现随着体外培养时间的延长，ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。常静等〔25〕发现与胎儿心肌细胞的共同培养，能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化，人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。Passier等〔26〕采用无血清培养基诱导胚胎干细胞，发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍，如果在培养体系中加入维生素C，分化效率还可以再提高40%。Maxim等〔27〕发现HESC与骨髓基质细胞或OP9细胞共培养可诱导hESC向造血干细胞分化。Rambhatla等〔28〕观察到，hESC 培养过程中在二甲基亚砜和丁酸钠依次诱导下形成肝细胞。裴海云〔29〕等将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7 d，形成囊性拟胚体，接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿，以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导，条件诱导液培养14 d，结果证实人胚胎干细胞经上述方法培养可向肝细胞分化。李彬等〔30〕采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化，得到了高比例的神经前体细胞。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式，为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。Reubinoff等〔31〕报道，hESC培养过程中加入bFGF、维甲酸和神经生长因子后可形成大量的神经管样结构，并能进一步分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。Vogel〔32〕将人ES细胞培养至拟胚体(EBs)后，用神经细胞培养基(常规培养神经细胞的培养基)培养，分离出部分分化的EBs在含碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。Kwon等〔33〕在实验中将TATPDX1融合蛋白转入HESC，从而激活下游靶基因的表达，促进干细胞分泌胰岛素，比较明确的阐明了干细胞向胰岛细胞分化的机制。Kroon〔34〕等将人胚胎干细胞源性胰腺内皮层移植进入大鼠后有效的产生葡萄糖应答内皮细胞，表明人胚胎干细胞有能力产生葡萄糖应答和胰岛素分泌细胞。Tremoleda〔35〕等比较人胚胎干细胞与成体干细胞的体内骨分化能力，结果经过成骨因素予处理的hESC均产生成骨，未经过成骨因素予处理的hESC产生骨与软骨;而未经过成骨因素予处理的hMSC则不形成骨、软骨与脂肪组织，经过成骨因素予处理的hMSC产生骨与脂肪组织。Masakatsu等〔36〕确定了人ES细胞分化为血管细胞成分的过程，从而为血管再生医学奠定了基础。Christian等〔37〕则通过研究得出结论，维甲酸和骨形态发生蛋白两种信号协同，可大大提高人的ES细胞向上皮细胞的直接分化的效率。石伦刚等〔38〕成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化。分化获得的细胞增殖能力强，表达间充质干细胞的特异性标志，并具有多向分化潜能。到目前为止，人类胚胎干细胞被成功诱导分化为造血干细胞、神经干细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、成骨细胞、内皮细胞及滋养细胞等多种细胞，为hESC分化细胞的移植研究与应用奠定了实验基础。同时，国外学者将人胚胎干细胞源性神经祖细胞移植于远端中脑动脉阻塞的大鼠，在移植后的2个月，移植细胞表达神经元标志物且部分改善大鼠的感觉运动功能〔39〕，展现了人胚胎干细胞在移植与再生医学的良好前景。
4.2 人胚胎干细胞的临床应用 hES可诱导分化为多种细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝脏细胞等，通过移植取代体内死亡或无功能的细胞提供长期治疗，可为帕金森病、心脏病、青少年糖尿病和白血病和肝脏疾病等多种临床疾病无限量提供细胞移植供体，从而使此类疾病在治疗上发生革命性变化〔40～44〕。Roberto研究表明，随着胚胎干细胞研究的发展，将其诱导分化为成熟的多巴胺能神经元及用来激活自身体内的修复机制，治疗帕金森病是可能的〔45〕。通过hESC建立体外分化模型，建立各种基因改变的hESC，可发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用，从而研究人类发育早期事件。遗传工程技术的应用，在体外定向改造ESC细胞后，可对胚胎干细胞进行基因改造，将特殊改变的基因转导至胚胎干细胞中，体外选择后将胚胎干细胞导入机体，使胚胎干细胞中的遗传信息传达给子代〔46～48〕，这可能有助于某些遗传性疾病的治疗。还可将胚胎干细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入，用于研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响，模拟细胞、组织在体内对被试药物及毒素的反应情况，为药物筛选和潜在的毒素筛选提供更安全、廉价的模型。尽管采用干细胞移植治疗疾病的研究取得了较大进展，但离临床应用还存在相当的距离。
5 问题与展望
胚胎干细胞在揭示生命，药物筛选、新药开发，移植治疗及研究胚胎发育和疾病发生和遗传性疾病具有极为广阔的前景〔49〕，但目前尚有许多的问题需要我们去解决，首先，须进一步的改善人胚胎干细胞的分离、培养、建系的工作〔50〕，明确细胞分化的触发与调控机制，掌握体外控制干细胞定向分化技术，控制ES细胞将特定细胞分化的基因和环境信号，将ES细胞定向诱导生成一种特定的细胞及一个复杂的组织或器官，建立更多的hESC系并对其特性进行研究，解决现有的hES细胞仍达不到临床应用的标准、可能存在异源蛋白污染及长期体外培养的hES细胞出现分化比例偏高和基因突变，甚至染色体也会出现非整倍体改变的危险。其次，细胞或组织移植后，可能存在ESC致癌或形成组织瘤问题;胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于患者的替代性治疗，存在免疫排斥反应问题，如何克服移植排斥反应是hESC成功应用于临床的前提;体细胞核转移技术所需时间长，对实验室设备要求高以及分化细胞的增殖。因此，只有进一步深入研究，才能为人胚胎干细胞在治疗性药物筛选、临床细胞治疗和组织工程等方面的应用奠定良好的基础。
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干细胞培养技术篇（11）
【关键词】 脊髓损伤； 神经干细胞移植； 磁共振成像； 大鼠
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI) 后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的研究改变了这一观点。NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞，是神经系统发育早期特定的细胞群体，它具备干细胞共有的特点，即能长久地保持增殖和分化能力［1］。随着分子影像学的发展，干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个突破点［2］。本研究利用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide，SPIO) 标记NSCs，对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪，探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。
1 材料与方法
1.1 胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定［3］
取胚龄14 d SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞，以1×105ml－1种瓶，用DMEM/F12(1∶1)无血清培养基［内含bFGF 20 ng·ml－1、EGF 20 ng·ml－1、B27 20 ng·ml－1］培养。每6～7 d换液、传代1次。
对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张，4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min，然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原，室温孵育30 min，吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗)，4 ℃孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗，室温孵育1 h，然后50%缓冲甘油封气，荧光显微镜下观察并摄像。
1.2 NSCs的标记和染色
细胞传至第3代，取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培养基中，37 ℃振荡60 min，使SPIO终浓度为25 μg·ml－1，将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12 h完成标记。
NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10％血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7 d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3遍，含2％亚铁氰化钾的6％盐酸溶液常温孵育30 min，显微镜下观察。
1.3 实验动物分组与SCI模型的制作
66只成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，随机分为假损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法［4］制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠(30 g·L－1)按40 mg·kg－1腹腔注射麻醉，背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上，常规消毒，腰背部正中切口，逐层分开显露T8～T10椎板，行T9全椎板切除，显露硬脊膜，钳夹固定T8及T10棘突，用10.0
g的不锈钢棒(直径为2.5 mm)沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落，打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上，后者将打击力传递给脊髓，造成大鼠脊髓不完全损伤，致伤后迅速移开打击物，逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩样扑动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2 ml，以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染，每天1次，持续3 d。注意保温，分笼饲养，自由取食，每天8：00及20：00行膀胱按摩协助排尿，直至建立反射性排尿。
1.4 细胞移植
将第3代悬浮培养的NSCs悬液用台式离心机离心5 min(1 000 r·min－1)，将细胞团以少量培养液吹匀，细胞计数为105μl－1。C组动物SCI后9 d于损伤节段下0.5 cm处用5 μl微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中，注入2 μl NSCs悬液，逐层缝合切口。
1.5 运动功能评分
BBB评分［5］为总分21分的运动功能评分，考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置，表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观，易于掌握，与脊髓功能恢复有极好的一致性。分别在动物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周进行盲法BBB评分，由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。将动物置于直径1 m的平面光滑场地自由活动5 min，记录动物后肢运动情况。
1.6 MR检查
于术后第1、3、5周分别行MR检查，扫描序列为T2WI。麻醉方法同前。
1.7 统计学处理
所有数据以x-±s表示，采用SPSS 12.0统计软件处理，组间比较采用t 检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结
果
2.1 NSCs的培养和鉴定情况
2.1.1 细胞培养 NSCs在无血清培养基中进行体外培养，能保持其未分化的多潜能状态，换液后细胞生长迅速。培养1周左右，随着NSCs的不断扩增，形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。
图1 培养7d时NSCs于无血清培养基中
形成的神经球 ×200
2.1.2 NSCs的鉴定 NSCs是一类未成熟细胞，选择性地表达某些抗原标志，如巢蛋白(nestin，属中间丝蛋白)。本实验巢蛋白免疫荧光检测结果示神经球有明显的荧光(图2，见封二)。
2.2 普鲁士蓝染色结果
显示100％的NSCs胞质内有细小的蓝色氧化铁颗粒（图3，见封二）。
2.3 运动功能评分
见表1。所有动物在损伤术后1 d双下肢全瘫(BBB评分为0)，随后BBB评分有自发恢复，实验选用的大鼠在SCI后第9天BBB评分＜7。A组大鼠在各评分时间点均为21分。细胞移植后1～5周，C组与B组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。表1 不同时期各组BBB评分结果
转贴于
2.4 1.5 T MRI
将SPIO标记的NSCs移植到C组SCI下位1周后行1.5 T MR检查，见移植处在T2WI序列呈低信号改变，第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变（图4）。
图4 NSC移殖后第5周在SCI部位有低信号改变
3 讨
论
SCI是一类中枢神经系统严重的致残性疾病，过去认为中枢神经组织不可再生，因此对SCI的治疗显得束手无策。但自1992年Reyonlds等［6］首次报道体外成功分离神经干细胞至今，中枢神经系统不可再生的观念已彻底被打破。NSCs的出现为SCI的治疗带来了希望。在大量的SCI实验研究中，对NSCs的应用主要集中于单纯的NSCs移植、以NSCs为载体的转基因治疗及NSCs联合生物材料的应用3个方面。本实验就是对单纯的NSCs移植治疗SCI进行进一步验证。应用NSCs治疗SCI的本质是实施细胞替代（cell-replacement），通过移植的NSCs大量增殖分化，替代损伤的脊髓组织，重建神经通路。提高NSCs移植后存活率并定向调控其向神经元分化是现今研究的重点。SCI后的脊髓内环境不利于NSCs的存活及分化。实验发现SCI后产生大量的神经毒性物质，例如IL- 1、IL- 6 和TNF- α，这些神经毒性物质导致了移植的NSCs死亡或分化成为胶质细胞，这些物质在损伤后24 h内大量产生，24 h后开始减少，选择合适的移植时间将会显著提高NSCs的存活率并促进其向神经元分化［7］。Coumans等［8］也发现SCI后6周行胚胎脊髓移植能促进脊髓再生并使后肢功能得到明显改善。Okano等［9］认为SCI后存在一个“窗口期”，在“窗口期”内进行NSCs移植治疗SCI可能取得更好的效果，窗口期大约在SCI后的7～14 d。延迟移植明显提高了NSCs的存活率，一定程度上促进了NSCs向神经元分化。但是时间过长损伤处形成瘢痕细胞又难以修复。另外，Suzuki等［10］发现，NSCs球较单层培养的NSCs在SCI后移植存活和移行能力更强。本研究对SCI模型造模后9 d移植NSCs，此时急性炎症已消退，微环境进入修复阶段，有神经生长、营养因子的表达及微血管的形成，有利于移植细胞的存活。同时，NSCs分泌的神经营养因子有利于轴突再生及突触形成。观察BBB评分发现，NSCs治疗组神经功能恢复明显好于损伤对照组，差异有统计学意义。
开展干细胞治疗的挑战之一就是移植后干细胞的分布和归宿。在中枢神经系统的不同病理、生理条件下，移植的NSCs有着不同的迁徙和分化能力，对干细胞这一特性的研究目前多为在移植后的一定时间内处死实验动物，对神经组织进行切片。而这些侵袭性的方法，不能对NSCs在同一动物体内的迁徙、增殖情况进行动态的观察，故需要非侵袭的手段来对移植入体内的NSCs进行监测。MRI可以提供25～50 μm的分辨率，接近单一细胞的水平，使其理论上可以用来对移植的细胞进行活体示踪。应用新型的MRI对比剂SPIO标记NSCs，以其独特的超顺磁性，利用MRI可以对NSCs移植后的迁徙、增殖情况进行动态观察。SPIO为一种颗粒物质，是一种新型的MR细胞内对比剂。作为超顺磁性MR对比剂，它可以影响局部磁场均匀性，同时产生磁化率效应(susceptibility effect)，从而加速共振质子的失相位，使T2弛豫时间显著缩短，此类对比剂的T1效应相对较弱。SPIO是由晶体氧化铁作为颗粒核心，用稳定剂如右旋糖酐(又名葡聚糖)或羧葡聚糖膜所包裹。它主要通过以下3种机制选择性标记干细胞：（1）直接胞吞作用：将被葡聚糖包被的SPIO直接放入培养基中，与用于移植的NSCs共同培养，标记细胞。（2）受体介导的胞吞作用:在已进行的研究中，SPIO颗粒多与转铁蛋白共价结合，结合后的复合物放入培养基中和干细胞共同培养。（3）转染试剂转染后介导的胞吞作用：一种是阳离子物质转染后介导的胞吞作用，另一种是脂质体介导的胞吞作用。本实验在NSCs移殖后3～5周行MRI检查SCI部位可观察到低信号改变。表明NSCs可以定向地向损伤区域迁移，此时BBB评分显示细胞移殖治疗组与损伤对照组有显著性差异，说明随着移殖细胞向SCI区域迁移数量的增加，大鼠运动功能也得到明显改善。利用这种非侵袭的方法，对移植入体内的NSCs进行动态监测。此项技术应用于临床，对移殖的干细胞进行标记，无创检测移殖的细胞在体内存活和迁移的情况，同时与功能评分相结合，可以对研究和治疗对象进行实时、持续的观察。
随着干细胞移植技术的日益成熟、干细胞标记技术研究的深入以及MRI技术的迅速发展，可以预期该项研究将会对SCI的治疗产生深远的影响，对神经康复医学及医学影像学的发展作出巨大的贡献。
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