生物学的研究方法大全11篇

生物学的研究方法篇（1）

物理学作为一门以实验为基础的自然科学，在整个初中物理教学中需要更多解决和研究物理问题的方法。因此，教师要引导学生养成善于发现问题、解决问题的习惯，运用不同的研究方法，解决各种各样的物理问题。例如，在教学《认识压强》时，我利用实验教学的方法：准备一个小圆桌的模型、一些沙子和砖块进行实践操作，要求学生：①把圆桌正面朝上放在沙堆上，测量桌脚陷入沙中的深度。②在圆桌上放上砖块并正面朝上地放在沙堆上，测量桌脚陷入沙中的深度。③把圆桌反面朝上放在沙堆上，测量桌脚陷入深度。④把放有砖块的圆桌反面朝上放在沙堆上，测量桌脚陷入深度。这时，我提出问题：“通过这四次的实验，我们发现了什么？”学生通过动手、动脑，很快得出压力和受力面积的大小是影响压力的重要因素。在教师正确地引导下，促使学生理解和巩固物理知识、发现和掌握研究方法，进而提高他们的物理素养。

二、要引导学生总结研究物理问题的方法

在物理教学中，教师还要及时地引导学生学会总结研究问题的方法，促使学生积极主动地参与到物理教学中来。在教授《物态变化》时，我设计了这样一个教学片断：要求全班学生分组总结“物态变化”的研究方法，结合所学知识及应用，进行物理方法的划分、对比、归纳。在探讨中总结以下几种《物态变化》所采用的研究方法：（1）比较法的运用。如比较刻度及使用方法的异同点、比较晶体与非晶体的熔化和凝固时的特点。（2）控制变量法的运用。如影响蒸发快慢有三个因素，要研究温度对蒸发快慢的影响时，可控制液体的表面积和液面上方空气流动情况。这种方法也在研究弦乐器的音调与哪些因素有关中运用了。（3）图表法的运用。通过列表了解自然界中不同物体的温度差异，分析不同晶体的熔点。（4）实验方法的运用。如测量不同温度的水，学习正确使用温度计及读数的方法，通过实验认识各种物态变化及相应的热量吸收与放出，引导学生总结研究物理问题的方法，不仅活跃课堂气氛，让学生有意识地把学习与方法相结合，培养自身的逻辑思维、信息收集、信息处理的能力，在总结教学过程中，达到提高学生综合能力的目的。

生物学的研究方法篇（2）

中图分类号：G648 文献标识码：B 文章编号：1672-1578（2014）07-0002-01

1.植物群落物质组织水平与结构的数学理论与方法应用

群落生态优势、群落均匀度、生物多样性指数是最多的植物群落物种组织水平与结构反映的数学方法。Abp指数、PIE指数、香农-维纳指数为生物多样性指数，其中效果较好的为香农-维纳指数，公式为：或者

计算群落均匀度的公式为：

辛普森指数可计算出群落生态优势：

通过现实中的森林群落运用，群落物质组织水平与结构可通过上述几个式子求得，群落间的不同生境也可由测定值得到。以上三中数学方法测得的环境梯度值可用来评价环境值质地。此外群落演替表征可在测定植物群落各层次的多样性结构实现，群落多样性若为发展期，呈由上到下的指数增加；如果是衰退期，则相反。趋于一致的各层次多样性多出现在群落的稳定特征。

2.种群生态学测定

测定种间关系是种群生态学的重点，其计算可由下式得到：

种群分布格局是种群生态学的主要研究内容，自身特性、环境因素与种间关系效益会影响种群分布格局。格局规模分析、频度X2的预期与实测、方差/均值比率与负二项式等为种群分布格局测度模型。但是，站在方法学角度，面积大小制约样地取样法，无样地取样法则不受限制，但对热带亚热带森林中的高度物种多样性而言，样地取样法更具优势，当然，这要在无生态学原理制约的基础上。

3.定量分析植被与群落

聚类分析、排序技术在定量分析植被与群落上较为广泛，但其以环境坐标、梯度为依据，从理论上对植物群落进行定位与排列，同时对其相似度在n维空间反映；也可通过相似的群落距离实现聚合成类。变异植被体系、主导植被变化因子、植被结构组成等都可通过这两种技术建立、反映与分析。煮坐标分析、位置向量排序组平均法、追分量分析以及极点排序等是常用的聚类分析与排序技术。但线性排序法是主要排序方法，非线性为生态学过程特征，所以，以低维空间现实排序结果，信息会大量损失。

4.群落演替、稳定性中数学理论方法应用

在群落演替、稳定性的研究上，实现了离散描述演变为定量研究的过度。以系统分析为出发点，把演替阶段看做是子系统或者状态，系统则是植物群落的演替过程，群落的阶段演替即为系统的转移状态。子系统、状态就是群落演替系统的一部分。马尔科夫模型可对此过程做定量解释。以S（X）为系统，满足叠加原理，那么：

效应强度为E，在群落边缘相邻位置存在的群落数量为m，定量的群落种群结构与数量为Y，某个群落的指标为yi。在不同的指标下，可以拟合yi与Y，比如和香农-维纳指数的拟合可得：，应用该式测定森林群落中的物种边缘强度，效果佳，边缘相邻位置的效应强度可通过测定值比较得到，也能明确正负效应，比如，1测定值，为负效应。

5.结语

数学生态学科研究范围较为，层次分明。比如，数学理论与方法在生态学研究上的适应程度是第一层，第二层是研究应用数学方法、模式和应用结果。前者被称作是生态数学，后者在于以数学为手段分析生态学，促进生态学理论进步，可以叫做是数学生态学。二者是矛盾的统一体，相互联系，本文立在讲述后者的应用。

在数学生态学研究过程中，应该有机统一数学与生态学。比如，关于排序结果中排序轴有何必要性，要与生态学理论相结合方发现其内涵，理论定位才没有白费。再如，各聚类级在聚类分析中的生态学必要性，也离不开生态学理论。所以，数学生态学的进步，不能将数学、生态学脱离，同等重要。数学的忽视则定量分析无效，生态学的忽视则存在"只有数字，没有植物"结局。

参考文献：

[1] 李嵩，郑新军，唐立松等.基于异速生长理论的准噶尔盆地荒漠灌丛形态研究[J].植物生态学报，2011，35（5）：471-479

生物学的研究方法篇（3）

（一）教学效率较低 

在高中教育阶段，生物课程的整体教学质量相对较低，因为高中生物课程本身涉及的内容较初中时期，已经变得更广了，内容上更加丰富，知识也更偏向于微小生物周期等的研究，并且知识点相应也增加了很多。如果单纯按照教学目标和课本内容依次讲解，对于学生的理解是有一定难度的。根据生物课程的特征来说，内容交叉相关的也很多，另外生物课程本身的抽象性，给教师和学生都带来了一定难度，所以，在高中生物教学过程中需结合一定的教学方法以促进教学。 

（二）重视课程进度，忽视教学本质 

对于现阶段而言，教育行业在我国的社会地位也是很高的。对于高中教育阶段更是教育的重要阶段。所以对于教师来说，对生物教学课程的安排相对来说相对紧凑，往往按照教学重点顺序进行授课，从而忽略了生物课程的学习是一个完整的过程，除了对重点知识的学习，还应加强生物基础知识的学习，并且在实体课堂中构建适宜的学习氛围和教学方法，以促进后期生物的学习。对于高中生物的教学本质不只是让学生掌握生物圈的发展进程，更是了解生命存在的意义。通过生物的基本概念的学习，了解生物课程中知识点的内涵，从而继续后期的学习。 

二、高中生物概念教学方法的引入 

（一）高中生物概念教学的含义 

生物概念教学法指的是在生物教学中以生物课本的基本概念知识为基础来进行生物知识的扩展学习。生物概念是生物课程的重要组成部分，生物概念体现的是对自然界以至整个生物界中具有相同特征的物体或者生命体的集合。生物概念的出现也体现了生物科学家和研究人员的伟大成果。 

（二）高中生物概念教学的引入背景 

根据2011年修改后的《义务教育生物学课程标准（2011年版）》中要求的，课程标准要求课程要凸显科学本质，需加强并重视概念知识的学习，在课标内容标准中筛选并呈现了50个重要概念。这也体现了生物概念学习的重要性。在现今，高中教育阶段，生物课程的深入学习也带动了学生的全面发展，拓宽了学生的视野，对生物概念教学的引入也是提高生物教学效率的必然发展要求。 

三、高中阶段生物概念教学的相关研究 

（一）高中阶段生物概念教学的教学关键点 

在高中生物教学中，为加强学生的学习效率和理解能力则需加强概念教学。但是在生物的教育过程中，涉及的知识点很多，所以在生物教学过程中需注意以下关键点。 

1.相似名词概念的区分 

高中生物中相似名词的内容和知识点很多。例如，“囊胚”与“胚囊”的区分，从概念上来区分，囊胚是指在动物胚胎发育过程中，受精卵通过有丝分裂，细胞增多，而形成空腔的球状胚，则为囊胚；而胚囊是由植物的胚珠大孢子母细胞通过减数分裂和有丝分裂形成的。所以需通过实质概念进行区分，否则会造成知识的混杂。又如，“半透膜”与“选择透过性膜”的区别，半透膜是指某些物质可以透过，而另一些物质不能透过的多孔性薄膜（如动物的膀胱膜，肠衣、玻璃纸等）。它只能让小分子物质透过，而大分子物质则不能透过，透过的依据是分子或离子的大小。不具有选择性，不是生物膜。选择透过性膜是指水分子能自由通过，细胞要选择吸收的离子和小分子也可以通过，而其他的离子、小分子和大分子则不能通过的生物膜。所以概念间的关系是有关联也有差异的。 

2.教师的适宜讲解 

在实体课堂教学过程中，教师和学生是重要的主体，教师起引导作用，学生应多思、多辩才能取得相应教学目标。在生物课程中也是如此，将概念教学的引入时，教师作为引路人，应先让学生初步理解，然后教师为辅进行教学沟通，要避免教师全盘讲解而使学生失去兴趣，同时在教学过程中注意并强调基础概念的重要性，以便促进后期生物教学。 

（二）高中阶段生物概念教学引入的意义 

生物学的研究方法篇（4）

中图分类号：G633.91 文献标识码：A 文章编号：1992-7711（2013）11-0024

通过《生物课程标准（实验稿）》可知，关于概念的学习在高中生物中占据着比较重要的地位。高中生物中的基本概念有许多，许多生物学概念比较微观、抽象，如何帮助学生理解抽象的概念是教学中经常遇到的难点。假如我们教师在教学过程中能将抽象的概念具体化、形象化、直观化，则有助于学生理解和掌握生物学概念。下面通过一些笔者在生物教学中用到的具体例子与读者共同探讨对这些概念的教学方法。

一、举例说明法

在高中生物《分子与细胞》中，学生刚开始学习的第一章的第一节讲生命系统的结构层次时会学到“种群”和“群落”这两个词，它们在必修二和必修三还会再次学到，可以说是高中生物中的核心概念。在开始学习生物时，教师要尽量使学生理解透彻，这对学生以后的学习态度和信心都非常重要。因此，笔者在讲解这两个概念的时候，先自己简单举例，然后耐心地找学生举例说明，再让其他学生找其中的毛病，这样能使学生印象更加深刻。

种群指在一定时间内占据一定空间的同种生物的所有个体。群落是指在一定生活环境中的所有生物种群的总和。

教师举例：一个池塘中的所有鲫鱼就是一个种群，一个池塘中的所有生物就是群落。然后反问学生：“一个池塘中的所有鱼属于生命系统的什么层次？”

学生开始的时候因为刚学完种群和群落这两个词就容易掉下陷阱，有的说属于种群，有的说属于群落。于是教师再提示：一个池塘中的所有鱼可不可以有鲤鱼、草鱼、鲢鱼等多种鱼，从而使学生明确一个池塘中的所有鱼并不是一个种群；接下来再问学生：“一个池塘中除了鱼有没有水草、藻类、小虾、细菌等其他生物？”从而使学生明白一个池塘中的所有鱼并没有包括这个区域中的所有生物，它也不属于群落。通过先让学生掉下陷阱，然后再引导学生思考，使其得出正确的结论来加深印象。

二、形象类比法

心理学研究表明，人大多数是采用形象、直觉、灵感等去探索和发现客观规律。有些概念比较抽象，对这些抽象概念的理解必须找出中心语，同时列举出生动形象的模型做比喻，这样才能使学生容易理解和终身难忘，课堂教学效率自然也就能提高。

比如，理解“染色质和染色体是同一种物质在细胞不同时期的两种存在状态”，为了让学生更好地理解它们的关系，笔者就让学生把染色质想成铁丝，而铁丝螺旋化后缩短变粗的弹簧就相当于是染色体，这样就可以形象地记住染色质和染色体。再如，在讲授“DNA双螺旋结构”时，把DNA的双螺旋结构比喻成摩天大楼的螺旋状楼梯，把交替连接在外侧的脱氧核糖和磷酸比喻成楼梯扶手，内侧的碱基对比喻成台阶。当然，比喻只能借助某事物认识概念，再贴切的比喻，也不能代替概念本身。我们最终必须把对概念的认识归结到概念的本质上来。

三、图形演示法

在讲解某些概念尤其是一些不容易区分的概念时可以用简单的图形来表示，通过一系列的图来讲解一个或几个容易混淆的词有助于学生理解透彻。比如在讲与细胞周期有关的一些概念时笔者就用了这种方法。

细胞周期：连续分裂的细胞，从一次分裂完成是开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。

方法一：细胞周期：BB；间期：BA；分裂期：AB。

方法二：细胞周期：a+b或c+d；间期：a或c；分裂期：b或d。

四、比较记忆法

所谓比较，就是引导学生对生物概念的形成过程和本质特点加以比较。许多复杂的生物概念只有借助于比较，才能区别一般和特殊的属性并突出其特征，明确其相似性和差异性。

任何概念虽然都是相对独立的，但其间也有一定的内在联系和区别。在教学上，如果将同一类别的概念并列起来，学生对近似的概念就不容易混淆了，例如复制、转录与翻译的概念。复制：以亲代DNA分子为模板合成子代DNA的过程。转录：以DNA的一条链为模板按照碱基互补配对原则合成信使RNA的过程。翻译：在细胞质中核糖体上进行的，以信使RNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。

生物学的研究方法篇（5）

一、科学方法教育对初中生物的作用分析

在生物教育研究中，科学方法教育自始至终都是着重研究的课题，不管是从提高民族的整体素质角度还是当前的课程改革的时间来讲，做好生物科学教育的方法的教学工作，都具有深刻的时代意义。

教育不断改革的今天，非常有必要对中学生进行科学方法教育，自己动手试验，这样可以使学生以最好的学习方式，主动接受最新的授课知识。例如在探究非生物因素对某种动物的影响时，教师能引导学生总结生物生存所需要的因素、作出假设、设计实验、进行试验、作出假设，然后在小组内交流讨论，这样，不仅可以让学生知道实验不仅仅只有大科学家才能做，学生也可以，而且在实验过程中可以让学生找到学习的乐趣。

在整个生物教学中，教师和学生是一个不可分割的整体。对于学生来说，包括学生在观察生物现象、形成生物认识、认识生物规律以及分析解决科学问题的过程中，所涉及的认知结构以及有关知识内容和科学方法基础的准备程度等都与科学的方法教育有着极大的联系。

对于教师来说，科学的方法教育表现为教师教学设计时，能够对学生学习的内容了解，针对每个单元列出详细的科学方法目标，并且能在最好的时机将科学方法教育带到初中生物的教学之中。比如在学习植物的绿叶光照下可以制造有机物的过程中，教师必须根据教材先找出可以进行此实验的素材，如天竺葵，而其他的植物如白薯叶也可以进行这个实验，而如果教师考虑使用菠菜叶就不可以，原因是菠菜叶不可以积累淀粉，所以不能使用。所有的授课，都需要教师的精心准备才可以的。

二、结合教材对科学方法教育在生物教学实践的研究

苏教版教材体现了以学生为主的教学理念，用科学方法教育把学生带到学习中做学习的主人，培养和发展学生的主体性，这是苏教版教材的教学的根本任务。对此，在生物的学习授课过程中，可以借鉴其优点，发展学生的学习主体性。以学生为中心的理念要在课程中充分体现，根据学生的思想与认知程度，在课堂中设计问答、思考与讨论等多种形式的活动，使学生全身心投入课堂，真正做学习的主人。

在新的一轮课程改革中，我国已将教学目标从过去的一维发展到三维。苏教版教材一将科学方法教育带到了教学实践当中，取得了良好的效果。据此，将科学方法教育带到生物的教学实践中，会进一步提高学生的科学素养，提高教师授课知识的效率，为学生终身发展、应对现代社会未来的发展的挑战奠定了基础。

例如对于《种子的萌发条件》这节课程，重点在于让学生了解种子萌发条件及其内部变化。这就需要教师引导学生进行探究实验，得出结论，让他们在实验中观察现象。根据科学方法教育的理论，教师在设计思想的时候可以采取实验与讨论的教学方法，让学生在课前充分预习，并且能够在课前试验，得出种子萌发所需的内部条件。在课堂上，教师可以让学生做课堂的主人，讨论观察的结果，引导学生的思考，并得出结论。随后，教师可以让学生讲述自己所学种子萌发这一课的方法、过程、结论，将科学的方法教育在初中生物课堂上实践起来。

生物学的研究方法篇（6）

一、创设情景，引导学生投入到探索与交流的学习活动之中

通过创设情景，提高学生的学习兴趣，激发学生的求知欲望，主动参与探究和讨论，在探究过程中获得知识。

1.设计实验或多媒体课件创设学习情景，激发学生学习兴趣和探索热情。例如，在讲“细胞膜 ——系统的边界”一节时，设计一个小实验：一个小烧杯装有热水，另一个小烧杯装有自来水；然后分别向两个小烧杯加入一朵新鲜的大红花；让学生观察实验结果，然后进行讨论。通过讨论，有的同学说是：热水使细胞破裂，从而使里面的物质流出来；有的同学说是：细胞被热水烫死了，里面的物质就流出来了，而自来水中的花的细胞还是活的，物质就不能流出来。通过讨论，学生的学习兴趣就调动出来了，充满探究激情。

2.设计情境式问题、探究式问题等方法，引发学生对知识产生认知需要，主动参与探究。如讲“遗传的基本规律”时采用提问式导入课题，“为什么有的同学是双眼皮，有的是单眼皮？”“为什么有的同学父母都是双眼皮，而他却是单眼皮？”“为什么有的同学是双眼皮，而他们的姐妹却是单眼皮呢？”通过探究性的提问，调动了学生的学习兴趣，积极参与讨论和学习过程。

二、结合生活实例，让学生提出问题，自主探索

1.教师可根据当前社会发生的生物事件或问题，让学生讨论交流观点，然后让学生自己确定想要了解的某一事件或问题，通过自主探究学习，体验事件或问题的性质或规律。例如，结合社会上发生过的SARS和禽流感事件，让学生讨论和探索。通过讨论，有些学生结合所学的生物知识提出了许多问题：如SARS、禽流感、口蹄疫等病毒的遗传物质是什么？它们的寄主有哪些？这些病毒的生存会受到哪些因素的影响？这些病毒是通过什么方式传播的？人体会产生免疫功能吗？应该怎样去预防这些病毒？为了解决提出的问题，学生就以个人或小组为单位确定调查项目，然后利用各种媒体如报刊、杂志或Internet等，查阅和收集资料并进行分析总结。

在这一过程里，充分发挥了学生的主动性，由学生自己提出问题和解决问题，从而获得知识；使学生懂得如何收集资料、分析资料和归纳资料，同时也培养了学生的科学观，懂得从生物学的角度去科学地认识和理解社会的某些事件。

2.利用课文的“资料分析”让学生开展探究性学习。如在学习“免疫调节”时，以课文的“资料分析”为基础，开展“关注艾滋病”专题讨论，让学生用所学的生物学知识来发表自己对艾滋病的认识，以及如何运用生物学知识原理去预防和治疗艾滋病。培养学生的探究学习能力。

三、探究性实验教学，让学生独立完成实验过程

例如在讲“能量之源——光与光合作用”时，在学习了普利斯特利和萨克斯的实验基础上，引导学生设计实验去验证“光合作用需要光”，以及引导学生设计实验验证“细胞膜是选择透过性膜”。激发学生的探究精神、实验能力和动手能力。为了让学生掌握溶液培养法来研究植物的必需矿质元素，首先设计实验小组：1.完全营养液培养某种植物（三个实验小组均使用生长状况基本相同的同种植物）。2.缺N元素的营养液培养同种植物。3.缺P元素的营养液培养同种植物。然后教师与学生一起准备实验材料：配制营养液，选取生长状况基本相同的同种植物。让学生理解到实验材料的准备也是十分重要的。最后让学生自己管理及观察实验，实验后学生自己总结实验结果，并思考为什么要设计实验小组。通过探究式实验教学，使学生懂得实验在科学研究中的重要性以及掌握探究实验的基本方法和技能的科研态度。同时培养了学生的观察能力、动手操作能力和分析能力。

生物学的研究方法篇（7）

本节课主要包括四部分内容：“孟德尔一对相对性状的杂交实验”、“对分离现象的解释”、“对分离现象解释的验证”、“分离定律”，这四部分内容间的逻辑性很强，层层深入.本节教材的主导思想是以孟德尔发现遗传因子的实验过程为主线，突出科学史和科学研究方法的教育，而这也是必修2模块的一个教育侧重点，所以在模块2中具有非常重要的作用和地位.

2.学情分析

学生在初中阶段已学习与本节有关的一些基础知识，对基因与性状的关系、基因的显性和隐性、相对性状等概念有一定的认知，这对于本节的学习有一定的帮助，因此教学中，教师应该引导学生努力回顾旧知.但学生还不知道有关减数分裂的知识以及基因的本质问题，因此对于孟德尔提出的四点假说的理解和领悟上有一定的难度，教师可引导学生通过自己动手做模拟实验来体验孟德尔假说.另外教师可以提供一些验证假说的方案，让学生在分析讨论过程中，真正理解孟德尔测交实验的目的.

二、教学目标

1.知识与技能目标

能说明孟德尔选择豌豆作实验材料的优点；掌握孟德尔的一对相对性状的杂交实验方法和对实验现象的解释及验证；区别自交、杂交、测交、相对性状、性状分离、纯合子和杂合子等基本概念；阐明分离定律的内容和实质.

2.过程与方法目标

通过课前调查和课堂模拟实验培养动手能力和分析、整理归纳能力；讨论孟德尔杂交实验的相关数据，形成科学的实验分析习惯；会分析孟德尔研究的步骤，形成对假说―演绎法的初步认识；能够运用分离定律解释和预测一些遗传现象，锻炼解决实际问题的能力.

3.情感态度与价值观目标

体验孟德尔遗传实验的科学方法和敢于质疑、勇于创新、以及严谨求实的科学态度和科学精神.

三、教学重点与难点

1.重点

一对相对性状的杂交实验；对实验现象的解释及验证，阐明分离定律；进行科学方法的教育；用分离定律解释一些遗传现象.

2.难点

对分离现象的解释；假说―演绎法.

四、课前准备

1.学生分组完成两个任务

以班级小组为单位，两个组的学生通过书籍和网络等渠道查阅资料（内容主要包括孟德尔的生平事迹、孟德尔杂交实验的科学背景），其他组的学生根据教师设计的表格对本年级同学及其父母的眼睑特征（单、双眼皮）进行问卷调查，并以表格的形式对数据进行统计和处理.

2.设计问卷调查的两个表格

3.性状分离比模拟实验的材料用具

两个相同的纸袋（甲和乙）、两种不同颜色的玻璃珠各20颗（如黑色代表含D的配子、白色代表含d的配子）.

4.设计性状分离比模拟实验的实验结果记录表

学生阅读课本上“问题探讨”中的资料，了解“融合遗传”的观点.

结合学生的汇报，教师适当补充，并作以下几点总结：①孟德尔自幼酷爱自然科学，通过对自然科学和数学的学习，孟德尔具有了杂交可使生物产生变异的进化思想，以及应用数学方法分析遗传学问题的意识.②在实践中孟德尔选用豌豆、玉米、山柳菊等植物，连续进行了多年的杂交实验研究，其中最成功的是豌豆实验.③当时科学界开展对多种动植物的杂交实验，孟德尔总结了前人的经验，创新研究方法，如从单一性状入手观察分析遗传结果；用前人从未在生物学研究领域用过的数学统计方法进行分析研究；敢于挑战传统的观点――融合遗传，提出了颗粒遗传的思想等.

教师设疑：豌豆具有哪些特点？为什么说孟德尔最成功的杂交实验是豌豆杂交实验？

让学生走近“遗传学之父”这一科学伟人，产生对孟德尔的钦佩和感动之情，体验孟德尔敢于质疑、勇于创新、坚持不懈的科学态度和科学精神.

结合图片和课本上的示意图以及注解，尝试概括豌豆作为理想实验材料的一些优点，并思考两个问题：.杂交实验的含义是什么？如何通过纯种间的杂交获得杂种后代？人工传粉时要注意哪些事项？

请大家阅读课本“一对相对性状的杂交实验”，并思考讨论：

1.为什么子一代表现高茎？矮茎性状消失了没有？如何来证实这一点？2.为什么子二代又出现了矮茎？

3. F2出现3∶1的性状分离比是必然还是偶然？是个别还是普遍现象？如何证明？

4.如果不用数学统计的方法分析遗传结果，会发现F2呈现3∶1的数量比吗？

教师通过幻灯片展示豌豆植株及花的结构图，师生共同总结优点：①自然状态下豌豆自花传粉（且闭花受粉），产生纯种；②具有稳定遗传的、易于区分的性状，如课本上列出的7对相对性状，通过观察很容易区分；③豌豆花大，易于进行人工杂交，获得真正的杂种.

结合以上内容，教师引导学生联系初中的知识，介绍两性花、单性花、自花传粉、异花传粉，并给出相对性状、父本、母本、自交、杂交、正交和反交等基本概念.

找到了理想的实验材料，接下来我们一起来学习孟德尔到底是如何进行杂交实验并揭示遗传奥秘的.

通过前面我们对孟德尔的了解，大家已经知道了，孟德尔获得成功的原因还归功于其研究方法的创新，他在研究杂交实验的过程中，采用由简到繁的观察方法，即先观察一对相对性状的遗传再研究两对相对性状的遗传.

那么，如果选择豌豆的高茎和矮茎这对相对性状来研究的话，杂交实验该怎么做？杂交后代的茎高度可能是怎样的呢？

大家的实验设计和预测结果跟孟德尔的一样吗？

教师介绍孟德尔的正交和反交实验，强调孟德尔实验的严谨性.关于矮茎性状是否消失、如何证实的问题教师提出两个方案让学生讨论：1.用F1和矮茎豌豆杂交，看后代是否出现矮茎豌豆；2.让F1自交，看后代是否出现矮茎豌豆.

生物学的研究方法篇（8）

物理是初中学生在学习过程中所必须面对的一门基础课程，学习好物理知识对于学生日后的工作生活都有着十分积极的作用。但在教学实践中很多老师都会发现学生对于物理学习的积极性并不高，这中间很大一部分原因在于很多学生对于物理课程认识不足，缺乏学习兴趣。在物理教学中如何才能够更好激发学生的学习兴趣，这成了目前初中物理教学过程中一项十分重要的内容。以下结合工作实践，就初中物理教学中激发学生学习兴趣的方法进行了阐述。

一、充分进行课堂导入环节的设计，激发学生学习物理的兴趣

对于初中学生来讲，物理课程是一门新接触的课程，在一开始学习的时候学生往往都抱有很高的积极性。但是如果老师处理不好，很有可能会使得学生失去学习的兴趣，一些学生甚至还会产生厌烦的情绪。这就要求老师在教学的过程中做好课堂导入的环节，争取一个良好的开端，为课堂的成功奠定良好的基础。物理教学的课堂导入方法是多种多样的，可以采取讲一个物理故事吸引学生注意力的方式，也可以通过小实验的方法让学生快速的进入到课堂的听课环节。比如“纸杯烧水”这类比较有趣的实验就能够很好的集中学生的注意力，学生通过观察物理演示，使得自身的好奇心与求知欲得到很好的激发，以激起物理学习的兴趣。

二、帮助学生制造成功体验，激发学生物理学习的兴趣

通过课堂导入可以使得学生物理学习的兴趣得到激发，但是如果想要很好的维护学生的学习兴趣，老师在教学中就必须要为学生制造成功的体验，这样学生才能够在物理学习的过程中获得成就感，物理学习的积极性也就更加高涨，学习的效果也更好。

对于刚刚接触物理课程的初中学生来说，他们往往对于物理学习有着比较浓厚的兴趣，如果老师在教学的过程中能够多给予他们一些肯定，让学生能够通过点滴进步感触到成功的喜悦，那么他们物理学习的兴趣就会越来越强。反之，如果在教学中老师经常他们所犯的错误则会大大挫伤学生学习物理知识的积极性。这就要求初中物理老师在教学过程中精心设计教学的方式，如在平时的测试过程中注意将题目设置的稍微简单一点，通过在测试之后对于学生取得的进步要多进行表扬与肯定，这样就可以为学生制造出一种成功的体验，使得学生能够很好的享受成功的喜悦，这样学生学习物理课程的信心也会相应的提升。

三、创设物理情景，激发学生探究物理知识的兴趣

老师在物理课堂的教学过程中，精心的创设教学情景，不仅有利于直接提升学生学习物理知识的积极性，同时还可以营造良好的课堂氛围，促进学生创造性思维的培养。比如在学习“透镜”一节的时候，就可以采取创设情境的方法进行教学，首先老师可以提问平行主光轴的平行光线经（凸、凹）透镜方向怎样？通过物理实验之后可以得到答案，然后老师可以继续创设情境，不平行主光轴的平行光线射入（凸、凹）透镜后又会怎样？然后再通过实验得出答案，通过设疑，实验求解的过程不仅仅可以解答出知识，同时还能够使得学生对于透镜的认识更加的明确，从而产生强烈的求知欲望。

四、重视实验教学的效果，激发学生物理实验的兴趣

物理实验是学生获取物理知识的重要途径，通过发挥实验在物理学科教学中的作用，符合物理教学中学生为主体、老师为主导的教学原则。物理实验可以很好的激发学生学习物理知识的兴趣，对提升物理课程课堂教学质量也有着一定的积极作用。

学生在预习和自学物理知识的过程中会遇到一些疑难问题，对一些比较新的物理概念也了解的也不够深入，有时候不能很好的理解就会有一些畏惧的情绪，这会影响到学生学习物理的效果。老师在教学中可以通过做小实验的方法帮助学生克服困难。

五、运用多媒体技术，激发学生学习的兴趣

多媒体技术是一种有效推动教育向前发展的重要手段，在物理教学的过程中，使用多媒体手段可以很好的激发学生学习的兴趣，调动学生参与到课堂的学习中。比如在初中二年级物理课程中“浮沉的条件及应用”的教学中，老师就可以制作多媒体课件，通过视频展示轮船、潜水艇等上浮下沉实际应用的画面，这样学生的注意力就会很快被吸引，这时候老师再进行课堂的讨论，就可以非常轻松的引导学生探究新的知识。这样的教学情景学生会产生更多的感受与启发，同时可以很好的提升初中物理课堂的教学效果。

在物理教学的课堂上借助多媒体教学，可以使得老师在教学中轻松的引领学生进入到虚拟的物理情景中，让学生能够一种身临其境的感觉，这样学生的学习兴趣就会倍增，学生也从被动变为主动。比如在学习光散的过程中，老师就可以通过多媒体先展示一副美丽的彩虹，然后对学生进行提问，天空中为什么会出现彩虹？如何才能够造出同样美丽的彩虹，然后再讲解新课程。这样就可以很好的激发学生学习的兴趣，同时也可以让学生对于物理知识产生更加深刻的印象。

六、小结

兴趣是学生物理学习最好的老师。作为初中物理的教学老师，在物理教学的过程中，要针对学生的特点进行精心的设计，使用多种方法充分激发学生物理学习的兴趣，培养学生学习物理知识的主动性和积极性，使得学生可以产生强烈的求知欲望和巨大的学习动力，从而促进学生物理学习成绩的提升，更好的完成物理教学的目标。

参考文献：

[1] 赵玉民.谈如何激发和保持学生学习物理的兴趣[J]. 黑龙江生态工程职业学院学报. 2010（04）

生物学的研究方法篇（9）

【中图分类号】G412.65 【文章标识码】B 【文章编号】1326-3587（2012）03-0091-01

在普通高级中学物理教学中，开展物理解题方法的研究，是高中物理课程改革的一项重要举措，它符合“以德育为核心，以创新精神与实践能力培养为重点”的素质教育的要求。高中物理解题能力是学生综合能力的集中表现，它既可以表现学生的动手能力，也可以表现学生分析问题的能力。开展物理解题方法研究，其目的是改变学生单纯地接受教师知识传输的方式，帮助学生形成一种主动探求，并重视解决实际问题的积极的学习方式，在解题过程中全面培养学生综合运用所学知识的能力、分析和解决问题的能力、语言文字表达能力、领导组织管理以及团结协作的能力，培养学生独立思考的习惯，激发学生的创新意识。开展物理解题方法研究，能更大程度地调动学生的学习积极性，充分挖掘学生的潜力。我们通过实际操作，取得了明显效果，具体步骤如下：

一、创设学生体验、思考的空间

1、学生读书的空间。要给学生充分的读书时间。例如学习摩擦力时，先让学生看书，反复阅读教材内容，找到书中的关键知识、重要字词，然后通过独立思考、分析来理解其真正的含义，如果发现不很清楚的地方，学生可以查找其它资料。这样培养了学生的动手能力，也培养了学生看书的习惯，从而设计学生活动来实现身临其境的直观感受，读书有了活动的指导思想。

2、学生活动的空间。要给学生活动的空间，也就是给学生充分表现自己的空间。例如学生阅读摩擦力内容之后，根据自己设计的活动方案，展开丰富多彩的活动，有两人相互拉的、互相推的，有一个人推物体的，形式多种多样，既充分调动了学生的积极性，又增强了学生的直观感受，有了认知的客观基础。

3、学生思考的空间。要给学生思考、分析、比较、讨论的空间。学生通过活动有了亲身感受，纷纷议论，各抒己见，展开更加激烈的口舌之战，既培养了学生的思维，也培养了学生的语言表达，掌握了正确的基础知识，更重要的是学生掌握了认知规律。

二、教师对习题的选择

1、联系实际、联系生活。物理问题来源于生活，所以我们要从生活中找一些学生接触多、有亲身感受的实际问题来编写习题，这样才有利于学生运用已掌握的知识、规律来找到解决问题的方法，从而顺利地解决问题，激发浓厚的学习兴趣，更加投入地去完成物理学习。

2、多层次选择习题。教师选择习题的原则，应偏重于应用基本知识、基本规律，应用新旧知识的联系，理论联系实际。通过多层次的习题选择及解答，能使不同层次的学生获得不同的效果，既使学生巩固了基本知识，也能使学生学到解题方法，还能培养学生的能力，同时让学生掌握了认知规律，教师做到了面向全体学生。

3、拓展课本例题的教学功能。加班加点和题海战术，从短期看，可能有一定成效，但从长远看，有碍学生的全面发展，还会使教学陷入“课内不足课外补”的恶性循环。笔者认为，要提高教学质量，关键是要提高课堂教学效益，拓展课本例题的教学功能，这是一种提高课堂教学效益的有效方法。

例如高中物理课本（必修课）第一册第四章“功率”一节，有一个关于轮船最大速度的例题，该题是求轮船在额定功率下行驶的最大速度问题。

为了拓展知识，我将该题的条件改变，布置了一道课堂练习题：

一辆停在水平平直路面上的汽车，质量为5×103kg，发动机的额定功率为60kW，设汽车在运动中所受阻力恒为车重的0.1倍，若它从静止先以0.5m/s2的加速度匀加速开出，行驶中汽车的速度达到最大所用时间为（ ）

A、等于16s B、大于16s C、小于16s D、无法确定

在课堂练习中，多数学生认为，汽车匀加速开出后，当输出功率等于额定功率时速度达到最大，因而错解为：

由F-f=ma，得F=ma+f=0.75×104N。设汽车的最大速度为v，由P=Fv，得v=P/F=8m/s；由v=at，得t=v/a=16s。故汽车开出后经16s速度达到最大，A为正确答案。

上述错解在于没有对汽车的运动过程进行深入分析，想当然地把汽车匀加速运动的末速度作为行驶中的最大速度。而实际上汽车的运动过程分为三个阶段：第一阶段，匀加速运动，各量的变化为a恒定（F-f=ma不变、v增大）P增大（P=Fv）。第二个阶段，输出功率不变，各量变化为：v增大（P=Fv、P不变、），F减小（F-f=ma、f不变），a减小。第三阶段，以最大速度做匀速直线运动。

三、学生对习题的选择

教师给学生选择习题，既有教师对学生的引导作用，也对学生的学习过程、学生必须掌握的知识有了明确的要求，有利于引导学生学会分析问题的方法。但缺少学生实践的过程，因此还要给学生创造自己应用知识的活动，那就是给学生自己选择习题解题的机会。通过选题，学生可以再现已有知识，识别知识，巩固旧知识，发现新知识；通过解题学生可以更加清楚地了解自己对所学知识理解、掌握的情况。教师可以通过检查学生选择的习题，了解学生掌握知识的情况，便于及时调节课堂教学，做到教师的教法适应学生的学法，更高效地完成教学任务。

学生选题的原则：（1）选择与教师所讲知识内容有关的习题；（2）选择与教师所讲习题相同和相近的习题；（3）可选择与以上不同的习题，但要说明所选习题与有关知识的联系及应用的规律。

四、教师检查学生作业的原则

1、面向全体学生的作业。教师要检查每位学生的作业，且要给予合理的评语，指出每位学生作业中的得失。

生物学的研究方法篇（10）

【关键词】 后囊膜混浊　细胞生物学调节　晶状体上皮细胞

Progresses of researching approaches and cell biology researches on posterior capsular opacification

AbstractPosterior capsular opacification is one of the main causes of visual ability decrease after cataract extraction combined with intraocular lens implantation. Its researching approaches are various with different advantages and disadvantages. Cell regulation system plays an important role in the forming of posterior capsular opacification. The present paper reviews the different researching approaches of posterior capsular opacification and related cell biological development.

· KEYWORDS: posterior capsular opcaification; cell biological regulation; lens epithelial cells

0引言

目前治疗白内障唯一有效的方法就是通过手术来恢复视功能。后囊膜混浊（posterior capsular opacification，PCO）是白内障手术的最常见并发症。PCO的出现会引起继发性的视功能丧失，需要进一步应用激光治疗，激光治疗费用较高，术后并不是没有风险[1]。现代白内障手术保留了囊袋，囊袋由部分前囊和整个后囊组成，起到隔离房水和玻璃体的作用，大部分囊袋内放置了人工晶状体。剩余前囊膜的晶状体上皮细胞会顽固地残留，这些残留细胞会重新增殖进入裸露的前囊区域，还会侵入人工晶状体的表面，占据前囊的外表面，最重要的还会分布在原来非细胞成分的后囊。细胞的持续性分化最后覆盖整个后囊而遮挡视轴。一薄层细胞不足以引起影响视路，随后出现的有基质和细胞成分的组织会引起光的散射。如果这些变化不断加重，视力将严重受损并需手术治疗。

1后囊膜混浊的研究方法

目前，用于研究后发性白内障的研究方法主要以下几种方法：细胞培养研究；活体动物研究；囊袋模型；活体观察；尸体眼的分析。这些研究方法各有利弊，却从不同角度为研究PCO提供了可靠的工具。

1.1细胞培养研究 这是最简单的研究方法，一般使用细胞系或从原位获取组织后原代细胞培养来分析其生长特征。这些实验能够确定哪些因子能够刺激或抑制生长。缺点是使用的细胞培养介质不是活体发生后发性白内障眼内环境，同时，培养的介质成分很大程度上不仅决定生长的速度，而且决定细胞的分子特性。例如，原位人晶体上皮细胞主要表达M1毒蕈碱的受体亚型，而人晶体细胞系HLE-B3表达M3亚型[2]。另外，在一些细胞系不表达αA-晶体蛋白，而αB-晶体蛋白和PAX6（眼主导基因）却被发现。并且，细胞培养所受到的干扰因素较大，单纯的晶状体上皮细胞培养必须加入一定浓度的胎牛血清，血清中含有多种生长因子，部分成分不明。但是，细胞系仍旧有许多研究价值，首先它提供哪些分子是有潜在研究价值的，在多大浓度下是有效的。而且，一旦被证实与更复杂的实验模型或尸体材料有相关性，这种易于获取的细胞系就是深入研究的最好体系。

1.2活体动物研究 最普通的动物模型就是兔。主要的缺点除了论理学上的考虑外，兔或猫动物体内细胞生长与于灵长类(动物) 有差别。同时，灵长类不同物种手术造成的创伤后具有不同的特殊表现[3]。另外，大多数信息只能在动物处死后检测到，不利于研究PCO发展的相关细节问题。

1.3囊袋模型 这种模型是在最近出现的，通过模拟一个虚拟的白内障手术获得，这种囊袋与活体的是一致的。囊袋培养体系需要有正常的基质，无血清条件下可生长。这类模型的一个重要方面就是如何维持囊袋的形状。一些研究组将环形结构植入囊袋内[4，5]，而另一些研究组使用细针固定维持环形结构[6，7，8]。同时，可以将IOL植入到这种模型里用来研究其所起到的作用。这种模型研究方法已经应用到人[4，6，7]，犬齿类动物[8]、牛的晶状体[5]上。人和犬齿动物都是接受了常规白内障手术，囊袋培养系提供了目前最直接的临床相关活体资料。国内黄瑾[9]有报道应用囊袋法体外培养晶状体上皮细胞的情况，认为可以建立较为稳定的体外环境，较为真实体现白内障囊外摘除术后的各种变化，体外培养的后囊膜上的晶状体上皮细胞的增殖、移行、皱褶形成、囊膜光散增强均与体内变化相似。

1.4活体观察 随着科学技术的发展，摄影系统已经发展到能够观察到视轴范围内的囊袋的细节改变[10，11]，能够随时观察患者的病情变化。尽管这项技术目前不能提供单一细胞水平的信息，却是观察PCO进展的较好方法。

1.5尸体眼分析 这种方法有利于理解哪些分子在囊袋内出现并参与了PCO。这些分子可能有基质成分、细胞标记物及生长因子。用来分析研究的技术包括；电子显微镜、免疫组织化学、RT-PCR和ELISA。通过这种方法得到的信息可以与其他提到的实验方法相比较。这种研究方法只能提供出与PCO病变相关的致病信息，不提供哪些分子与PCO进展确切的证据。

2细胞生物学调节系统

大多数白内障手术，术后晶状体上皮细胞将粘附于囊膜下，成为发生PCO的隐患。尽管PCO的发生过程，IOL起到重要作用，但PCO的严重程度依赖于细胞调节系统的本身。参与PCO发展的细胞调节信号来源于周围环境。这些调节因子来源于晶状体细胞本身或眼内其他组织，形成了自分泌和旁分泌调节方式。这两种调节系统提供了充足的信号信息进而维持细胞的生存与生长，参与PCO的发展过程。

2.1旁分泌调节 最初人们就认识到血——房水屏障破坏后房水中蛋白质含量增高，出现炎症反应的现象。有些蛋白质仅仅在眼外伤后的房水内存在，产生的多肽与蛋白质具有强大的调节晶状体细胞的功能。大量实验数据表明有多种因子调节控制不同物种的晶状体细胞生物活性。Davidson曾报道使用含有200μg/L的转铁蛋白培养介质能够明显增加LEC细胞的生存时间[12]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，能够以不同浓度使培养的鼠晶状体上皮细胞的增殖、迁移、分化速率达到最大化[13]。酸性成纤维细胞生长因子也有相似的作用，但是有效浓度要更大[14]。转化生长因子TGFβ是一种蛋白质，是参与伤口愈合和肉芽组织形成的重要生长因子之一，后囊膜混浊也是手术性创伤后机体的一种愈合反应过程，对TGFβ和PCO关系的研究一直是热门[15]。TGFβ通常存在于房水中，但多数是以隐匿的形式存在，外伤及手术刺激后其活性增加。 眼内合成的主要以TGFβ2为主，TGFβ1也能从血中进入房水中。将TGFβ加入鼠或牛晶状体上皮细胞胶原伐培养基能够诱导衬(下)层基质的收缩[16]。同时，加入TGFβ后可以诱导鼠晶体上皮细胞转化为平滑肌肌动蛋白SMA[17]，这一诱导过程特异性依赖TGFβ2和TGFβ3，且效果强于TGFβ1的10倍。大多数情况下，TGFβ增加细胞外基质的生成，抑制多数类型细胞的增值，并且诱导许多生长因子如结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子，FGF等。Wunderlich等[18]就报道了在尸体眼囊袋内存在结缔组织生长因子，这种特殊因子的表达与 TGFβ有关。

2.2自分泌调节 手术后短期内房水中的蛋白质迅速增高，在数周或数月内缓慢降低恢复正常。PCO出现后并不是需要马上二次手术治疗，这就提示在最初高血清蛋白质的条件下，PCO的不发展可以持续一段时间。这时就有可能存在另一调节系统——自分泌调节机制。由此可以推测，生长因子在正常水平的情况下，由晶状体分泌的大量的可发觉的蛋白质起到缓慢促进PCO进展的作用。Ishizaki等[19]研究鼠的晶状体细胞发现在无蛋白质培养基条件下细胞能够生存，他们也推断之所以避免由凋亡引起的细胞死亡而生存是依赖于下层基质和细胞密度。Wormstone等[7]揭示了用无血清培养基培养的人囊袋模型中晶状体细胞不仅能够抵御手术造成的破坏而且能够活跃地增殖和生长。这个重要发现揭示了晶体上皮细胞自分泌调节系统的存在。在牛、狗的晶状体细胞在类似条件下也能够生存[5]。晶状体细胞能够合成蛋白质，可能与血-房水屏障破坏后，为了适应不利的生存环境，晶状体细胞合成必需蛋白质维持其自身生存。其他的屏障系统（如血-脑屏障）破坏后，也会出现与晶状体相似的自分泌调节机制来维持生存[20]。

已有研究囊袋模型认为原位的晶状体上皮细胞是完整的自分泌系统。EGF和EGF受体在人晶状体上皮细胞表达[21]。应用囊袋培养系，能够鉴定出手术后不同时期的哪些信号成分出现，检测出它们在PCO发展中起到作用。通过RT-PCR技术研究培养的人晶状体囊袋，认为碱性成纤维细胞生长因子bFGF及FGFR1是参与潜在的自分泌途径的成分[22，23]。

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3防治晶状体后囊膜混浊前景展望

已经有多种不同方法用于防治PCO。术中行晶状体囊膜抛光可以有效减少晶状体上皮细胞的数量。但是，目前看来，通过这种方法不可能完全去除所有细胞，并且少量残留细胞可以引起后囊再生。与手术相关的技术改进主要针对眼内晶状体的创新。制备人工晶状体的材料有多种，各种人工晶状体在防治PCO发生的作用主要是由晶状体的物理特性决定的。现在认为，直角型晶状体能够形成一个屏障阻止细胞向后囊生长。这种设计方法的改进无疑对于防治后发性白内障是有效果的，但是仍不能完全杜绝后发性白内障的发生[24]。

目前有大量的药物通过体外抑制晶状体细胞的增长来防治PCO[25-29]。临床上，目前有3种方法通过药物减少细胞的增长，包括药物直接注入到前房，调整灌注液成分，调整人工晶状体成分。问题是，这些药物释放对其他组织有毒性作用，尤其是对角膜内皮的伤害。目前，释放药物的最佳途径就是通过人工晶状体，这样能便于控制药物的释放，同时局部达到较高浓度有利于原位抑制有潜在增殖能力的细胞。事实上，将人工晶状体的襻修饰上细胞毒性药物能够直接将药物释放到赤道部细胞。Behar-Cohen[26]曾经观了将FGF-皂草素复合物结合到肝素表面处理的人工晶状体后植入兔眼的效果，皂草素通过FGF与上皮细胞受体结合，并杀死细胞。这种方案出现了一些副作用，包括暂时性角膜水肿和虹膜色素沉着。药物释放系统既需要有保护作用有能够保证有用的药物释放。也有一些研究针对了药物缓释系统，这些材料通常是不透明，不能放置视轴部位，但可以应用到囊袋内张力环或襻上。

总之，用于研究防治后发行白内障的研究工作除了在人工晶体的改进方面取得了较大进步外，在研究方法上及细胞分子生物学方面也取得了可喜成绩，但还有许多问题需要解决。应用细胞分子生物学技术治疗后囊膜混浊是未来治疗后发性白内障的有效手段。

【参考文献】

1 Ranta P， Kivela T. Retinal detachment in pseudophakic eyes with and without Nd:YAG laser posterior capsulotomy. Ophthalmology ，1998;105(11):2127-2133

2 Collison DJ， Coleman RA， James RS， Carey J， Duncan G. Characterization of muscarinic receptors in human lens cells by pharmacologic and molecular techniques. Invest Ophthalmol Vis Sci ，2000;41(9):2633-2641

3 Bito LZ. Species differences in the responses of the eye to irritation and trauma:a hypothesis of pergence in ocular defense mechanisms， and the choice of experimental animals for eye research. Exp Eye Res ，1984;39(6):807-829

4 Nagamoto T， Bissen-Miyajima H. A ring to support the capsular bag after continuous curvilinear capsulorhexis. J Cataract Refract Surg ，1994;20(4):417-420

5 Saxby L， Rosen E， Boulton M. Lens epithelial cell proliferation， migration， and metaplasia following capsulorhexis. Br J Ophthalmol ，1998;82(8):945-952

6 Liu CS， Wormstone IM， Duncan G， Marcantonio JM， Webb SF， Davies PD. A study of human lens cell growth in vitro：A model for posterior capsular opacification. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1996;37(5):906-914

7 Wormstone IM， Liu CS， Rakic JM， Marcantonio JM， Vrensen GF， Duncan G. Human lens epithelial cell proliferation in a protein-free medium. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1997;38(2):396-404

8 Davidson MG， Wormstone M， Morgan D， Malakof R， Allen J， McGahan MC. Ex vivo canine lens capsular sac explants. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol ，2000;238(8):708-714

9黄瑾，谢莉娜，卞春及.囊代法观察兔晶体上皮细胞体外和后囊膜混浊.南京医科大学学报(自然科学版)，2004;24(3):259-264

10 Ursell PG， Spalton DJ， Pande MV， Hollick EJ， Barman S， Boyce J， Tilling K. Relationship between intraocular lens biomaterials and posterior capsular opacification. J Cararact Refract Surg ，1998;24(3);352-360

11 Hollick EJ， Spalton DJ， Ursell PG， Pande MV， Barman SA， Boyce JF， Tilling K. The effect of polymethylmethacrylate， silicone， and polyacrylic intraocular lenses on posterior capsular opacification 3 years after cataract surgery. Ophthalmology ，1999;106(1):49-54

12 Davidson MG， Harned J， Grines AM， Duncan G， Wormstone IM， McGahan MC. Transferrin in after-cataract and as a survival factor for lens epithelium. Exp Eye Res ，1998;66(2):207-215

13 McAvoy JW， Chamberlain CG. Fibroblast growth factor induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration. Development ，1989;107(2):221-228

14 Chamberlain CG， McAvoy JW. Induction of lens fibre differentiation by acidic and basic fibroblast growth factor. Growth Factos ，1989;1(2):125-134

15 Moustakas A， Pardali K， Gaal A， Heldin CH. Mechanisms of TG-β signaling in regulation of cell growth and differentiation. Immunol Lett ，2002;82(1-2):85-91

16 Kurosake D， Kato K， Nagamoto T， Negishi K. Growth factors influence contractility and alpha-smooth muscle actin expression in bovine lens epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1995;36(8):1701-1708

17 Gordon-Thomson C， Iongh RU， Hales AM， Chamberlain CG， McAvoy JW. Differential cataractogenic potency of TGF-betal1，-betal2，and -betal3 and their expression in the postnatal rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1998;39(8):1399-1409

18 Wunderlich K， Pech M， Eberle AN， Mihatsch M， Flammer J， Meyer P. Expression of connective tissue growth factor mRNA in plaques of human anterior subcapsular cataracts and membranes of posterior capsule opacification. Curr Eye Res ，2000;21(2):627-636

19 Ishizaki Y， Voyvodic JT， Burne JF， Raff MC. Control of lens epithelial cell survival. J Cell Biol ，1993;121(4):899-908

20 Espinosa de los MonterosA， Kumar S， Scully S， Cole R， de Vellis J. Transferrin gene expression and secretion by rat brain cells in vitro. J Neurosci Res ，1990;25(4):576-580

21 Majima K. Human lens epithelial cells proliferate in response to exogenous EGF and have EGF receptor. Ophthalmic Res ，1995;27(6):356-365

22 Wormstone IM， Del Rio-Tsonis K， McMahon G， Tamiya S， Davies PD， Marcantonio JM， Duncan，G. FGF: an antocrine regulator of human lens cell growth independent of added stimuli. Invest Ophthalmol Vis Sci ，2001;42(6):1305-1311

23王铮，夏群，刘小伟，崔宝华.人工晶状体后囊混浊对视功能的影响.国际眼科杂志，2006;6(2):377-380

24石海红，管怀进.人工晶状体的设计对后囊膜混浊的影响.国际眼科杂志，2004;4(5):882-886

25 McDonnell PJ， Krause W， Glaster BM. In vitro inhibition of lens epithelial cell proliferation and migration. Ophthalmic Surg ，1988;19(1):25-30

26 Behar-Cohen FF， David T， D'Hermies F， Pouliquen YM， Buechler Y， Nova MP， Houston LL， Courtois Y. In vivo inhibition of lens regrowth by fibroblast growth factor 2-saporin. Invest Ophthalmol Vis Sci ，1995;36(12):2434-2448

生物学的研究方法篇（11）

1 EHEC基本概况

大肠杆菌 O157：H7 曾多次在世界各地，特别是发达国家引起广泛的暴发流行。感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)，并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP) 并发症，严重威胁着人类的生命健康［2］。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。

EHEC菌株能产生毒素，编码这些毒素的基因包括志贺菌素1基因(st x1)、志贺菌素2基因(st x2)、大肠杆菌粘附与消除基因(eae)和肠溶血素基因(ehx)等。大肠杆菌O157:H7是与人类疾病相关的最常见血清型细菌。1982年，美国学者首次从出血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌，并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌O157:H7可作为一种病原菌使人类致病，但当时并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠杆菌O157:H7引起的感染在美国、加拿大、英国和日本等发达国家迅速增加，逐渐引起广泛重视。我国于1987年由权太叔等首次从出血性结肠炎患者粪便中分离到O157:H7大肠杆菌。此后，福建、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省陆续分离出该菌。为防止类似事件出现，1997年5月建立了全国O157:H7大肠杆菌检测网络。

大肠杆菌O157:H7对人的致病力较强，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。因此，在流行病学调查中，特异、灵敏及快速检测O157:H7的方法显得尤为重要。随着分子生物学技术的迅速发展，使得快速、准确检测O157:H7成为可能，并为该领域的研究开拓了更广阔的前景。

2 分子生物学检测方法

2.1 聚合酶链反应(PCR)技术

该技术是最常用的检测大肠杆菌O157:H7致病基因的方法。目前已从单一PCR发展到多重PCR乃至实时荧光定量PCR（RQ- PCR ）。Paton 等［3］ 采用多重PCR 方法扩增st x1 、st x2、eae、ehxA和saa基因，发现所检测的ETEC(大肠杆菌O157:H7是其中一种)中，有几种或全部为致病基因。Fey 等［4］ 对335份腹泻患者的粪便样品进行选择性细菌培养，再从中选择可疑菌落进行检测。用多重PCR的方法检测到14株ETEC，与联合应用传统的细菌分离培养和酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)相比，分离的菌株数相同。从而证明，PCR是一种与细菌常规分离培养和EIA联合应用、具有相同敏感性和特异性的方法。由于其速度快，可作为一种诊断由EHEC感染引起腹泻的替代方法。

近年来，随着RQ-PCR的发展，这种技术也被用于大肠杆菌O157:H7的检测。RQ-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常规PCR技术只能对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应进行实时检测。RQ-PCR通过对引物、探针或扩增产物进行荧光标记使对积累的扩增产物进行实时检测成为可能。Ct值即PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。朱海等［5］使用RQ-PCR检测生果、蔬菜中大肠杆菌O157∶H7，说明荧光定量PCR检测方法比传统分离培养法灵敏度更高。Bellin等［6］在45min内用这种方法检测了32个EHEC菌株中的st x1和st x2基因，证明实时定量PCR是一种快速检测EHEC的方法。同时，该试验对重复结果为阴性的试验也较为迅速。

因此，这种方法在处理大量怀疑含大肠杆菌O157:H7样品时可使用，如在临床微生物中粪便分析或食品安全性检验中的应用。

运用PCR方法检测与疾病相关的毒素基因还有助于对疾病发病机理的了解。有研究表明［6］，从ETEC感染患者体内分离的EHEC中，大部分含有与毒力相关的90kb质粒编码的ehxA基因。从引起出血性肠炎和HUS患者体内分离的EHEC中含有st x2和eae基因，而从无症状携带者分离的EHEC缺少eae基因，说明缺少eae基因也就使ETEC缺乏了肠上皮细胞的粘附机理。

2.2 限制性片段长度多态性(RFLP)

RFLP是根据不同样品(个体)基因组或某个基因的限制性内切酶的酶切位点之间发生了碱基的替换、重排、插入、缺失等，导致产生新的限制性酶切位点或丢失某些酶切位点。新切点的出现可使限制性片断的长度缩短，而旧切点的丢失可使限制性片断的长度增大。通过基因的PCR扩增、限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，在紫外光下直接观察，可比较不同样品(个体)DNA水平的差异(即多态性)。RFLP是目前细菌亚分类最常用的方法之一，该法也被成功用于大肠杆菌O157:H7的多态性分析。Zhang等［7］用PCR-RFLP对从人分离的大肠杆菌st x1基因的变化情况进行了分析，从有腹泻症状的患者分离的大肠杆菌中检测到st xB1，无症状携带者分离的大肠杆菌中检测到st xB1的等位基因(命名为st xB1c ) 。用限制性内切酶FspⅠ酶切282bp 的st xB1及st xB1c、st xB1 酶切的结果得到189bp和93bp两个片段；st xB1c没有被切开，用限制性内切酶HhaⅠ进行酶切，st xB1得到135bp、92bp和55bp 3个片段；st xB1c得到218bp和64bp两个片段。选择包括EDL933 的共6个菌株(均有st x1)作对照试验，酶切的结果与st xB1一致。从上述结果可见，只运用PCR技术无法解释相同病原菌编码相同基因引起感染却出现不同症状的情况，RFLP 方法为大肠杆菌O157致病机理的研究提供了一条更加有效的途径。

2.3 随机扩增多态性DNA(RAPD)

RAPD建立在PCR基础上，使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测其多态性。分析时所用引物数很大，虽对每一个引物而言，其检测基因组的DNA多态性区域有限，但利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。目前该项技术也被用于大肠杆菌O157:H7的多态性检测。Radu等［8］对从15份牛肉和3份鸡肉样品中分离出的28株O157:H7分别进行RAPD和PFGE分析，并绘制了进化树。RAPD将其分为两个组群，22个亚组群，PFGE将其分为两个组群，28个亚组群。Johnson等［9］对日本京都一家工厂暴发的大肠杆菌O157：H7感染调查中，也分别用RAPD和PFGE对从患者粪便中分离的O157：H7进行了多态性分析，并与在东京暴发流行该病时分离的菌株进行比较，发现两者的结果没有差异。在以PCR技术为基础检测DNA多态型的众多方法中，RAPD是一种快速、简单的方法。它为大肠杆菌O157：H7提供了一种高效区分不同亚组群的方法。虽然相对于PFGE其区分能力略逊一筹，但它快速简单，不像PFGE需要较长时间，可作为PFGE方法的参照。另外，RAPD对DNA的要求不高，只需少量模板就可用于扩增反应，适用于从食物样品和粪便中分离的多个菌株的分析。

2.4 随机片段长度多态性(AFLP)

AFLP技术由Zobeau 等于1992 年创立。该方法结合了RFL P 和RAPD 技术的特点，利用两种或两种以上的酶切割DNA ，形成不同酶切位点的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上双链人工接头，作为PCR 扩增的模板。对于PCR的引物，AFLP作了修饰，将引物与酶切片段识别序列结合起来，其引物从5′3′依次为核心序列、酶切识别序列、3′端选择碱基序列。而核心序列与人工接头互补，从而实现选择性扩增。DNA 片段经两种或两种以上的酶同时切割，如果遗传特性发生改变，则酶切片段数目、长短发生变化，从而实现多态性。Iyoda等［10］分析了46株大肠杆菌O157:H7和其他血清型大肠杆菌O26：11、O114：19、O119：N，结果显示，同一地区暴发分离的大肠杆菌O157：H7菌株的AFLP条带结果具有同一性，在亚分类时可将其归入同一组群。该结果与脉冲凝胶电泳得出的结果一致。Zhao等［11］利用该方法对48株O157:H7进行了分析，并在每对引物的一条引物带上标记荧光素，以便进行仪器解读，称为荧光AFLP(FAFLP)，共获得37种不同基因组的DNA指纹，PFGE获得21种，说明FAFLP在一定条件下可以提供更详细的PFGE不能区分的DNA样品指纹图。

Smith等［12］通过对71株O157进行FAFLP分析表明，FAFLP较目前的分子生物学分类方法在理论上更为先进，实际操作中更易于标准化。与PFGE方法相比，它可得到的大量更为详尽的数据，扩增片段可精确到±1bp。在相同的消化连接反应中，通过使用不同的选择性引物，可提高或降低其鉴别能力。

AFLP技术与RAPD技术一样，能产生丰富的多态性，但RAPD技术是在高Mg2+浓度、低复性温度、短引物序列(10bp)允许引物与模板错配等不严格条件下进行扩增，结果易受外界因素的影响，重复性较差［12］。AFLP技术则不同，引物与模板严格配对的碱基数多达17个，且在56℃退火温度下进行，其结果的可靠性高于RAPD。而RFLP等技术需要预先制备相应的DNA探针并进行杂交，才能得到较低多态性的结果［13］。AFLP技术克服了上述两种方法的缺点，即能获得较好的多态性，并且实验结果稳定、可靠、重复性好、分辨率高［14］。但AFLP技术也存在一些不足，如成本高、酶切条件及引物需要筛选、所需时间略长。

2.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变，小的DNA分子比大的变化快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小而呈现出电泳带型。DNA带的密度在一定程度上反映了细菌内DNA的含量以及DNA分子的大小，最终达到分型的目的。

PFGE常用于基因组DNA的分析，是目前分子流行病学调查最经典的方法［15］，已成功用于众多微生物的遗传性分析［16］，被世界上许多实验室作为菌株基因分型的参考方法，是迄今最常用的亚分类方法。目前对病原细菌常用的分子生物学分型方法有：RFL P，特定片段PCR，RAPD，基因外重复回文序列PCR(Rep-PCR)，裂解酶片段长度多态性(CFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)，Multiple-locus variable-number tandem repeats analysis，MLVA)以及Multiple-locus sequence typing，MLST)多位点序列分析等。PFGE与以上方法相比，具有重复性好、分辨率高［17］、结果稳定、易于标准化的优点，能在细菌基因组很庞大的情况下，尽可能反映较多的变异信息。但是也存在一定的缺点［18］，比如耗时；电泳带型易受人为等多种因素的影响；并不是对所有情况都适合；不能同时优化胶的每个部分的条带分布；不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段；不同条带之间并不是无关的、相互独立的，而是互相联系的；一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化；结果不易分析，没有国际统一标准，不易于在实验室之间进行比较，且仪器价格昂贵。

PFGE适用于检测较罕见的限制性内切酶产生数量较少，而片段较大的DNA片段，这些片段因分子量较大，常规电泳不能将其分开，但可用一个不断变化的(脉冲)电场将其分开。美国国家公共卫生实验室已完成了PFGE标准化流程的制定，并在多次不同的O157:H7暴发流行中应用。Xu等［19］从113只金龟子中分离到4株大肠杆菌O157:H7，从383份腹泻患者粪便中分离到10株大肠杆菌O157:H7。对分离到的14株O157:H7进行基因组DNA PEGF分析，其中4株从金龟子分离的O157:H7与9株从腹泻患者分离的O157:H7 PEGF的结果一致，从而证明14株O157:H7具有相同的起源。金龟子可能通过接触粪便而携带大肠杆菌O157:H7，并在粪便运输过程中传播该菌。Kruger等［20］对分别来自牛(59株)、羊(4株)和腹泻患者(33株)的大肠杆菌O157进行RAPD-PCR和PFGE分型。RAPD-PCR结果显示，总共96株菌只是在条带的亮度上有所差异，具有高度的单形性；PFGE结果则可将96个菌株分为76个不同的基因组形式，证明了PFGE在基因分型中的优势。Radu等［7］从食品中分离大肠杆菌O157进行的基因分型试验也证明了PFGE的优越性。PFGE已被证明，在大肠杆菌O157:H7的分子流行病学调查中是一种可靠的分型方法。

2.6 多位点可变数衔接重复序列分析(MLVA)

MLVA多用于哺乳动物亲缘关系的分析，近年来也被用来作细菌多态性检测，已有多种细菌采用该方法进行分型，如炭疽杆菌［21］、耶尔森菌［22］、结核分支杆菌［23］。在真核生物基因组中存在大量的数目可变的衔接重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)。VNTR是由几个核苷酸(最常见为2～4个)作为核心序列串联重复形成的DNA序列，在原核生物基因组中也发现了这种序列，但它的一般长度不到原核生物基因组的1/10。这种序列可存在于原核生物基因中，也可存在于基因之间。大肠杆菌O157：H7中发现，有7个VNTR，重复数从6～30个碱基不等，其中6个存在于染色体DNA上，另一个存在于编码毒力基因的质粒上。通过不同菌株基因组核心序列串联重复数的差异，可检测大肠杆菌O157：H7的多态性。Lindstedt等［24］用MLVA方法，将69株大肠杆菌O157分为45个不同型别，用PFGE方法将它们分为44个，证明ML2VA与PFGE相比具有相同的灵敏度和更高的特异性，具有很多优点。首先，它无需抽提基因组DNA；其二，该法重复性好，即使不同实验者也可得到相同的条带形式；第三，可制定统一标准，易于各实验室间进行比较；第四，能在较短时间内处理大量样品。运用分子生物学分型方法检测大肠杆菌O157：H7的多态性，为调查其是否潜在暴发流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工业中O157：H7的污染检测也更为方便，关键控制点易于找到，使得有适当措施被贯彻来保证食品的安全。

综上所述，大肠杆菌O157：H7有多种分子生物学检测方法。不同的方法各有优缺点，我们应该根据检测目的和实验室拥有的条件选择最适合的方法进行检测以及其他研究。

【参考文献】

张亮.美国大肠杆菌感染病蔓延，感染源凝为袋装菠菜［EB/OL］.2006-09-18. health.jxnews.com.cn/system/2006/09/18/002339449.

Li Y， Frey E， Mackenzie AM， et al. Human response to Escherichia coli O157:H7 infection: antibodies to secreted virulence factors ［J］. Infect Immun，2000，68(9):5090-5095.

Paton AW， Paton JC. Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1，stx2，eae，ehxA，and saa ［J］. J Clin Microbiol，2002，40(1):271-274.

Fey PD， Wickert RS， Rupp ME， et al. Prevalence of non2 O157:H7 shiga toxinproducing Escherichia coli in diarrhe al stool samples from Nebraska ［J］. Emerg Infect Dis，2000，6(5):530-533.

朱海， 杨泽，李小燕，等.生果、蔬菜中大肠杆菌O157∶H7 荧光定量PCR检测方法的评估及改进［J］.现代预防医学，2006，33（8）：1434-1439.

Bellin T， Pulz M， Matussek A， et al. Rapid detection of enterohemorrhagic Escherichia coli by realtime PCR with fluorescent hybridization probes ［J］. J Clin Microbiol，2001，39(1):370-374.

Zhang W， Bielaszewska M， Kuczius T， et al. Identifica tion ，characterization ，and distribution of a Shiga toxin 1 gene variant (stx (1c) ) in Escherichia coli st rains isolated from humans ［J］. J Clin Microbiol，2002，40(4):1441-1446.

Radu S， Ling OW， Rusul G， et al. Detection of Escherich ia coli O157:H7 by multiplex PCR and their characteriza tion by plasmid profiling，antimicrobial resistance， RAPD and PFGE analyses ［J］. J Microbiol Methods，2001，46(2):131-139.

Johnson JR， Kuskowski MA， Menard M， et al. Similarity berween human and chicken Escherichia coli isolates in relation to ciprofloxacin resistance status ［J］. Infect Dis，2006，194(1)：71-78.

Iyoda S， Wada A， Weller J， et al. Evaluation of AFLP，a high resolution DNA fingerprinting method ，as a tool for molecular subtyping of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 isolates ［J］. Microbiol Immunol，1999，43(8):803-806.

Zhao S， Mitchell SE， Meng J， et al. Genomic typing of Escherichiacoli O157:H7 by semi-automated fluorescent AFL P analysis ［J］. Microbes Infect，2000，2(2):107-113.

Smith D， Willshaw G， Stanley J， et al. Genotyping of verocytotoxin producing Escherichia coli O157 :comparison of isolates of a prevalent phage type by fluorescent ampli fiedf ragment length polymorphism and pulsed field gel e lect rophoresis analyses ［J］. J Clin Microbiol，2000，38(12):4616-4620.

Shima K， Terajima J， Sato T， et al. Development of a PCR-restriction fragment length polymorphism assay for the epidemiological analysis of Shiga toxin producing Escherichia coli ［J］. J Clin Microbiol，2004，42(11):5205-5213.

Valsangiacomo C， Baggi F， Gaia V， et al. Use of amplifed fragment length polymorphism in molecular typing of legionella pneumophila and application to epidemiological studies ［J］. J Clin Microbiol，1995，33(7):1716-1719.

Maslow JN， Mulligan ME， Arbeit RD， et al. Molecular epidemiology:the application of contemporary techniques to typing bacteria ［J］. Clin Infect Dis，1993，17:153-164.

Sonntag Anne-Katharina， Prager Rita， Bielaszewska Martina， et al. Phenotypic and genotypic analyses of enterohemorrhagic Escherichia coli O145 strains from patients in Germany ［J］. J Clin Microbiol，2004，42(3):954-962.

Hopkins KL， Hilton AC. Methods available for the subtyping of Escherichia coli O157 ［J］. World J Microbiol Biotechnol，2000，16:741-748.

Brian MJ， Van R， Townsend I， et al. Evaluation of the molecular epidemiology of an ourbreak of multiply resistant Shigella sonnei in a day care center by using pulsed-field gel electrophoresis and plasmid DNA analysis ［J］. J Clin Microbiology，1993，31:128- 133.

Xu J， Liu Q， Jing H， et al. Isolation of Escherichia coli O157:H7 f rom dung beetles Catharsius molossus ［J］. Microbi2 ol Immunol，2003，47(1):45-49.

Kruger A， Padola NL， Parma AE， et al. Intraserotype persity among Argentinian Verocytotoxigenic Escherichia coli detected by random amplified poldmorphic DNA analysis ［J］. Med Microbiol，2006，55(pt 5)：545-549.

Keim P， Price LB， Klevyt ska AM， et al. Multiple locus variable number tandem repeat analysis reveals genetic relationship s within Bacillus anthracis ［J］. J Bacteriol，2000，182(10):2928-2936.